低强度脉冲声波对大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的作用及机制研究

陈安忠 耿泽振 李德盛

(1.聊城市第二人民医院，山东 聊城 252600；2.中国康复研究中心运动疗法3科，北京 100068)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种严重危害中老年人身心健康的退行性关节疾病，其主要病理变化为关节软骨的磨损和退化。OA的临床表现为关节反复疼痛、关节功能障碍等症状[1]。关节软骨的主要功能是维持细胞外基质合成和分解代谢平衡，软骨细胞凋亡会打破细胞外基质的代谢动态平衡，进而破坏关节软骨结构和功能的完整性，最终导致OA[2]。

低强度脉冲式超声波(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)作为新型物理治疗方法，具有低成本、高安全性等优点，近年来在治疗关节炎中被广泛应用。研究表明，LIPUS具有促进软骨细胞增殖、促进关节软骨的缺损修复和软骨形成等多种作用[3-4]。本实验拟从体内水平研究LIPUS对OA的保护机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 10周龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量200～220 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2主要仪器与试剂 低频声波治疗仪(HT2009-1型)购于日本伊藤公司，TNF-α、IL-1β和IL-6测试盒，购自武汉博士德生物有限公司；β-actin，Bax，Caspase-3和p53抗体购自Abcam公司，二抗购自Santa crus公司。RT-PCR相关试剂均购于Thermo Fisher公司。

1.2分组与模型建立

1.2.1分组实验 大鼠在37 ℃恒温环境，自然光线下，昼夜12 h：12 h交替饲养，适应性喂养一周，过程中对动物的处置严格遵守2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。利用随机数字表法分为4组，每组10只：假手术组(Sham组)；模型组(OA组)；30 mW/cm2组；60 mW/cm2组。术前1 d剔除术区毛发。

1.2.2模型 建立本次实验构建内侧半月板撕裂(MMT)模型[5]，2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉，待大鼠肌肉松弛提示麻醉成功，将大鼠仰卧固定于手术台。术区常规消毒、铺单，取大鼠右后肢膝关节内侧纵行切口，长约2 cm，逐层切开，暴露内侧副韧带，将其切断，然后将髌韧带牵拉至一旁，镊子牵拉内侧半月板找到其与胫骨平台相连位置，尖刀半环状切断(避免尖刀损伤胫骨平台关节面)，镊子提起半月板暴露其髁间止点，并将其切断，取出半月板，予以止血，大量生理盐水冲洗关节腔后，逐层缝合，碘伏消毒。术后预防性应用青霉素3 d。Sham组切开关节腔但不切除内侧半月板，其余操作相同。LIPUS治疗4周后处死大鼠并取右后肢膝关节胫骨平台，一部分迅速置于-80 ℃冰箱中保存，另一部分固定液经固定后，常规石蜡包埋。

1.2.3LIPUS干预方法 MMT术后3 d起，对大鼠右膝关节处施加超声刺激，将超声发生器头固定于膝关节内侧，超声耦合剂充分结合，30 mW/cm2组及60 mW/cm2组治疗强度分别为30 mW/cm2、60 mW/cm2，其余参数为FREE模式，通断比20%，频率3 MHz，20 min/次，1次/d，共4周。

1.3检测方法

1.3.1番红固绿染色10%EDTA处理固定后标本3周进行脱钙，常规酒精脱水、浸蜡、石蜡包埋和切片(厚度4μm)，常规番红固绿染色。

1.3.2TUNEL染色石蜡组织切片经脱蜡水化处理后，修复抗原37 ℃与Proteinase K作用，封闭非特异性反应加上胎牛血清和小牛血清白蛋白，用PBS漂洗，加入TUNEL缓冲液，PBS漂洗，给予3%甲醇溶液阻断内源性过氧化物酶，PBS漂洗，再次封闭非特异性抗原加羊血清，PBS漂洗，加1∶2稀释的POD，PBS漂洗，DAB显色，苏木精衬染，通过光学显微镜观察，细胞核黄染为阳性着色。

1.3.3生化检查IL-1β、IL-6、TNF-α检测。各项指标检测方法严格按试剂盒说明书操作。

1.3.4RT-PCR检测Bax、Caspase-3、p53表达水平：RNA提取试剂盒提取组织总RNA，各组取等量RNA进行反转录，通过PCR扩增Bax、Caspase-3及内参β-actin的cDNA。每个检测点设3个平行反应管，以cDNA为模板对Bax、Caspase-3基因进行定量PCR扩增。引物序列如下：Bax，正义5’-GGTTGCCCTCTTGTACTTGC-3’,反义5’-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3’；Caspase-3，正义5’-ATGGAGAACAACAAAACCTCAGT -3’,反义5’-TTGCTCCCATGTATGGTCTTTAC -3’；p53，正义5’-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3’,反义5’-TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3’；β-actin，正义5’-CCCGCCGCCAGCTCACCATGG -3’,反义5’-AAGGTCTCAAACATGATCTGGGTC -3’。根据各反应管的靶基因循环阈值(Ct)和内参基因Ct值，采用比较Ct值法(2-ΔΔCt)计算Bax、Caspase-3、p53水平。

1.3.5免疫组化检测 Bax、Caspase-3表达水平石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复，血清封闭，滴加一抗，4℃冰箱过夜，滴加二抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。阳性判定标准：以被染成棕褐色为阳性结果。

1.3.6Western blot法检测 p53蛋白表达组织蛋白的提取：将标本储存于-80℃低温冰箱中，提取蛋白时取出标本称重，每100 mg组织加入1 mL RIPA，加入10 μL PMSF，组织匀浆，低温离心15 min，10 000～14 000 r/min，取上清加入5×蛋白上样buffer，煮沸5 min分装，-70 ℃保存，现用现取。提取蛋白后灌胶上样，加样后先用恒流(10mA)，再用恒压(100V)电泳至溴酚蓝到凝胶底部。待电泳停止后，将凝胶转移PVDF膜上，转移电压为100 V，时间120 min。然后将PVDF膜移至含有封闭液的平皿中，室温下摇床上摇动封闭2h。取出PVDF膜，加入稀释后的一抗(1∶1 000)冰箱里4 ℃过夜。再用TBST室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min。然后加入1∶1 000稀释的辣根酶标记羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h，用TBST室温下脱色摇床上洗5次，每次10 min。将显色剂滴加于晾干的PVDF膜上，显色照相。最后用quantity one软件对条带进行分析。

2 结 果

2.1LIPUS对IL-1β、IL-6、TNF-α的影响 与Sham组比较，OA组TNF-α、IL-1β和IL-6含量均增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与OA组比较，LIPUS组(30mW/cm2组和60mW/cm2组)TNF-α、IL-1β和IL-6含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与30mW/cm2组比较，60mW/cm2组中TNF-α、IL-1β和IL-6含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠软骨组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的比较

注：与Sham组比较aP<0.05；与OA组比较bP<0.05；与30 mW/cm2组比较cP<0.05。

2.2各组大鼠关节软骨结构的比较 番红固绿染色结果：Sham组大鼠关节面光滑，细胞排列整齐有序，未见细胞基质溶解；OA组大鼠关节面溃疡形成，软骨面严重剥脱，表浅软骨细胞严重缺失；30 mW/cm2组大鼠关节面较深裂隙形成，可见溃疡或少量软骨面剥脱，表浅软骨细胞部分缺失；60 mW/cm2组大鼠软骨细胞排列略紊乱，无明显关节面溃疡形成，软骨面轻微剥脱，表浅软骨细胞轻微缺失。见图1。

图1 各组大鼠关节软骨结构比较

2.3各组大鼠关节软骨凋亡细胞数比较 TUNEL法镜下显示Sham组可见极少量软骨细胞凋亡，散布在软骨表层；OA组可见大量阳性的凋亡细胞，呈片状分布；30 mW/cm2组可见的凋亡细胞数量明显少于OA组，但多于Sham组，不均匀分布于软骨组织中；60 mW/cm2组与Sham组比较，凋亡细胞数量增加，与OA组比较凋亡细胞数量明显减少，与30 mW/cm2组比较，凋亡细胞数量明显减少，部分凋亡细胞核破裂，核仁染成棕黄色。见图2。

图2 各组大鼠TUNEL结果比较

2.4RT-PCR及免疫组化检测 Bax、Caspase-3表达水平与Sham组比较，OA组大鼠的Bax、Caspase-3表达增高；与OA组比较，30 mW/cm2组和60 mW/cm2组大鼠的Bax、Caspase-3表达降低；与30 mW/cm2组比较，60 mW/cm2组大鼠Bax、Caspase-3表达降低。见图3。

注：与Sham组比较＊P<0.05；与OA组比较#P<0.05；与30mW/cm2组比较▲P<0.05。图3 Bax、Caspase-3表达情况

2.5各组大鼠关节软骨中p53蛋白表达测定 Western blot法蛋白含量检测显示，与Sham组比较，OA组p53蛋白表达均显著升高(P<0.05)；与OA组比较，LIPUS组(30 mW/cm2组和60 mW/cm2组)p53蛋白表达降低(P<0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)；与30 mW/cm2组比较，60 mW/cm2组中p53蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 各组大鼠关节软骨中p53表达比较

3 讨 论

骨关节炎主要病理特征是关节软骨退化和软骨细胞外基质破坏[6]，软骨细胞外基质主要由软骨细胞分泌[7]。研究[8]表明，OA中软骨细胞丢失率高达20%，这表明软骨细胞在维持细胞外代谢机制中起着重要作用，其凋亡会导致关节软骨退化。LIPUS能通过增强软骨周围基质黏附，激活细胞骨架形成，促进软骨细胞增殖[9]。软骨组织中一些敏感性较高的酶，如胶原酶，能对LIPUS的热效应做出反应，促进软骨细胞代谢，抑制软骨细胞凋亡[10]。此外，LIPUS能够促进血液与关节滑液之间的小分子物质交换，改善关节软骨营养[11]。

IL-1β、IL-6和TNF-α是体内重要的细胞因子。研究表明，细胞凋亡是由同源的IL-1β转化酶蛋白酶家族激活引起的。一方面，它将新合成的IL-1β前体转化为活性的IL-1β[12]；另一方面，它导致维持细胞结构和功能的基质蛋白分解，通过激活家族其他成员介导细胞凋亡[13]。IL-6影响多种细胞的生长、分化和基因表达。其表达异常与细胞凋亡密切相关[14]。TNF-α具有很强的促凋亡作用[15]。本研究发现，与Sham组比较，OA组大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高；与OA组比较，30 mW/cm2及60 mW/cm2组大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α显著降低；与30 mW/cm2组比较，60 mW/cm2组大鼠软骨组织中IL-1β、IL-6和TNF-α亦明显降低，表明LIPUS干预后，可减少软骨组织中促凋亡细胞因子，且60 mW/cm2效果优于30 mW/cm2。番红固绿及TUNEL染色结果表明，与OA组相比，30 mW/cm2及60 mW/cm2组关节软骨损伤程度明显减轻，细胞基质溶解及软骨面剥脱程度减轻，软骨细胞缺失减少，60 mW/cm2组较30 mW/cm2组损伤程度更轻。由此可见，LIPUS能通过抑制促凋亡细胞因子，减轻软骨细胞损伤及凋亡。

Bax是Bcl-2家族促凋亡的成员之一，Bax表达上调促进细胞凋亡[16]。另外，Caspase-3是一种定位于细胞质的非活性酶原，其能汇聚多种凋亡刺激信号。Caspase-3激活会导致细胞固缩、染色质凝聚和DNA断裂，进而细胞发生不可逆转的凋亡[17]。RT-PCR及免疫组化结果可见，与Sham组比较，OA组大鼠的Bax、Caspase-3表达增高；与OA组比较，30 mW/cm2组及60 mW/cm2组大鼠软骨组织中Bax、Caspase-3表达降低；与30 mW/cm2组比较，60 mW/cm2组大鼠的Bax、Caspase-3表达更低。这提示LIPUS可通过调控凋亡基因表达，从而减轻OA中关节软骨细胞凋亡。

细胞凋亡是一种基于遗传机制的细胞死亡形式，其诱导了一系列重要的病理生理变化[18]。p53是公认的凋亡基因，在细胞凋亡中起着重要作用。p53调控细胞凋亡的作用机制主要为两方面：抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡[19]。RT-PCR及western-blot结果可见，与Sham组比较，OA组大鼠的p53表达增高；与OA组比较，30 mW/cm2及60 mW/cm2组大鼠软骨组织中p53表达降低；与30 mW/cm2组比较，60 mW/cm2组大鼠的p53表达更低。这提示LIPUS可通过调节凋亡相关信号转导，减轻OA中关节软骨细胞凋亡。

综上所述，本实验从体内水平研究LIPUS对OA的保护机制，发现LIPUS可通过抑制促凋亡细胞因子、调控凋亡基因表达及相关信号转导等机制减轻OA中软骨细胞凋亡，这为临床使用LIPUS治疗OA提供新的实验依据。