炮仗花类胡萝卜素含量测定及抗炎活性研究

林启凰，林聪炜，张 娜，纪美茹，陈仲巍，张 岗*

(1.厦门医学院药学系，福建 厦门 361000；2.厦门弘爱医院，福建 厦门 361000)

炮仗花(Pyrostegiavenusta(Ker Gawl.))，别名黄鳝藤，为紫葳科炮仗藤属藤本植物，广泛分布于我国的华南和西南地区[1]，常用于庭院垂直绿化[2]。在民间，炮仗花的叶子和花被用于治疗白斑病[3]，并用于防治支气管炎、肺结核、咳嗽、流感等呼吸系统感染[4-5]。研究[6-7]证明，炮仗花提取物具有抗氧化、抗菌和愈合伤口等活性。化学成分研究表明，炮仗花橙色素主要组成为胡萝卜素、叶黄素等类胡萝卜素类物质[8]，是其花瓣呈橙红色的主要色素。

类胡萝卜素是由8个异戊二烯单元构成的长链萜烯化合物[9]，是公认的安全性食品补充剂和食用色素，对癌症、心血管病等疾病具有干预治疗作用[10]。由于长共轭体系的存在，大多数类胡萝卜素的紫外光谱在400～500 nm间有最大吸收峰[11]；而在此波长范围内，植物中的其它成分几乎无吸收峰。因此，可以采用分光光度法测定植物中类胡萝卜素含量[12]。目前，国内未有炮仗花类胡萝卜素含量测定的相关报道。鉴于此，作者采用超声波辅助法提取炮仗花类胡萝卜素，采用分光光度法测定其含量，通过红外光谱对其结构进行表征，并利用脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型评价其抗炎活性，以期对炮仗花色素的开发利用提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

炮仗花，于2019年3月采自福建省厦门市，经鉴定为紫葳科炮仗藤属植物炮仗花(Pyrostegiavenusta(Ker Gawl.))的花。

无水乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚(BHT)(分析纯)，西格玛奥德里奇贸易有限公司；β-胡萝卜素对照品(批号：H-02-180914)，成都瑞芬思生物科技有限公司。

Alpha型红外分光光度计，德国布鲁克；Shimadzu UV-1800型紫外分光光度计，日本岛津公司；PA225D型十万分之一分析天平,赛多利斯；N-2100X型旋转蒸发仪，日本Eyela公司；DHG-9140型鼓风干燥箱，上海一恒有限公司；KQ-300DE型超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司；Tecan Infinite M1000 PRO型酶联免疫检测仪,Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 对照溶液的配制

精密称取β-胡萝卜素对照品4.98 mg，用无水乙醇(含0.01%BHT，下同)溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配制成母液。精密移取母液5 mL，用无水乙醇稀释并定容至50 mL容量瓶中，作为储备液，备用。

1.2.2 供试溶液的制备

60 ℃烘干的炮仗花用粉碎机粉碎，过4号筛，备用。精密称取炮仗花粉末10 mg，置于100 mL棕色具塞三角烧瓶中，精密加入无水乙醇20 mL，称重，超声波(功率500 W)辅助提取20 min，放冷，再称重，用无水乙醇补足，过滤，取续滤液用于分析。

1.2.3 检测波长的确定

分别取β-胡萝卜素对照品和炮仗花提取物适量，加入适量无水乙醇，超声提取，过滤，滤液进行全波长紫外可见吸收光谱扫描，扫描范围200～600 nm。

1.2.4 标准曲线的绘制

分别精密量取β-胡萝卜素对照储备液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀；以无水乙醇为空白溶液，于450 nm处测定吸光度。以β-胡萝卜素浓度(x,μg·mL-1) 为横坐标、吸光度(y)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 炮仗花类胡萝卜素的结构表征

取炮仗花粉末适量，置于100 mL棕色具塞三角烧瓶中，加入适量无水乙醇超声波(功率500 W)辅助提取20 min，过滤；滤液低温蒸干，加入适量水混悬，用正己烷萃取3次，合并萃取液；无水Na2SO4干燥后，低温蒸干，得红棕色炮仗花提取物。检测前将提取物置于干燥器内干燥过夜，红外灯下以KBr压片，测定红外光谱。

1.2.6 抗炎活性评价

1.2.6.1 炮仗花提取物的制备

精密称取炮仗花粉末0.501 2 g，加入20 mL无水乙醇，超声波辅助提取20 min，过滤，滤液浓缩蒸干成浸膏，备用。

1.2.6.2 炮仗花提取物中类胡萝卜素含量的测定

精密称取炮仗花提取物15.51 mg，用无水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，于450 nm处测定其吸光度。

1.2.6.3 细胞毒性实验[13]

向含有一定浓度的小牛血清、青霉素以及链霉素的DMEM培养基中转入事先复苏的RAW264.7细胞，在CO2培养箱中37 ℃下培养细胞至对数期，以EDTA-2Na和胰酶作为消化液进行消化。将以上处理好的细胞悬浮液加入不同浓度的炮仗花提取物溶液，继续培养过夜，加入MTT溶液及DMSO，摇床振荡。采用酶联免疫检测仪于450 nm处测定吸光度，并根据下式计算细胞存活率：

细胞存活率=A样品/A空白×100%

1.2.6.4 NO抑制实验

采用Griess法[14]检测炮仗花提取物的NO含量。按1.2.6.3方法培养RAW264.7细胞，每孔加入不同浓度的炮仗花提取物溶液孵育1 h，加入1 μg·mL-1LPS溶液，继续培养24 h，收集细胞上清液，并按照NO试剂盒操作说明测定NO含量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

β-胡萝卜素对照品和炮仗花提取物的紫外可见吸收光谱见图1。

从图1可以看出，β-胡萝卜素对照品和炮仗花提取物均在450 nm处有最大吸收。因此，选择450 nm作为检测波长。

图1 β-胡萝卜素对照品(a)和炮仗花提取物(b)的紫外可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis absorption spectra of β-carotene reference substance(a) and Pyrostegia venusta extract(b)

2.2 炮仗花类胡萝卜素的结构表征

炮仗花提取物的红外光谱见图2。

从图2可以看出，炮仗花提取物在3 375 cm-1附近显示了强且宽的吸收带，为典型的-OH伸缩振动信号；3 010 cm-1处为烯烃=CH伸缩振动峰；1 641 cm-1、1 631 cm-1、1 612 cm-1处为共轭多烯中C=C伸缩振动峰；1 061 cm-1处为=CH面外弯曲振动峰，说明分子中含有共轭多烯结构；2 925 cm-1、2 854 cm-1处为-CH3、-CH2伸缩振动峰；1 462 cm-1、1 444 cm-1处为-CH3、-CH2面内弯曲振动信号。以上信息与类胡萝卜素结构相符[15-16]。此外，炮仗花提取物在1 738 cm-1、1 727 cm-1附近显示了C=O特征伸缩振动吸收峰，在1 260 cm-1、1 154 cm-1附近显示了C-O伸缩振动吸收峰，吸收强度均为中等，说明炮仗花提取物中部分化合物含有羰基或酯键官能团，炮仗花中类胡萝卜素极性较大。

2.3 提取方法的优化

2.3.1 提取溶剂

精密称取炮仗花粉末10 mg，共7份，分别加入无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚(60～90 ℃)、丙酮和正己烷各20 mL，超声辅助提取30 min，450 nm处测定其吸光度，考察提取溶剂对炮仗花类胡萝卜素提取率的影响，结果见图3。

图3 提取溶剂对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction solvent on extraction rate

从图3可以看出，以无水乙醇为提取溶剂时，吸光度最大。故确定提取溶剂为无水乙醇。

2.3.2 提取溶剂用量

精密称取炮仗花粉末10 mg，共6份，分别加入无水乙醇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL，超声辅助提取30 min，450 nm处测定其吸光度,考察提取溶剂用量对炮仗花类胡萝卜素提取率的影响，结果见图4。

图4 提取溶剂用量对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction solvent dosage on extraction rate

从图4可以看出，随着提取溶剂用量的增加，类胡萝卜素提取率逐渐升高，当无水乙醇用量为20 mL时，提取率最高；之后随着提取溶剂用量继续增加，提取率趋于稳定。故确定无水乙醇用量为20 mL。

2.3.3 提取时间

精密称取炮仗花粉末10 mg，共9份，加入等量无水乙醇溶液，超声辅助提取时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min，450 nm处测定其吸光度，考察提取时间对炮仗花类胡萝卜素提取率的影响，结果见图5。

图5 提取时间对提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate

从图5可以看出，随着提取时间的延长，类胡萝卜素提取率先升高后降低，20 min时达到最高。故确定提取时间为20 min。

2.4 β-胡萝卜素的标准曲线(图6)

根据β-胡萝卜素对照品浓度(x，μg·mL-1)和相应的吸光度(y)绘制标准曲线，拟合得β-胡萝卜素线性回归方程为y=0.1461x-0.0207(R2=0.9999)，β-胡萝卜素浓度在0.996～3.486 μg·mL-1范围内与吸光度具有良好线性关系。

图6 β-胡萝卜素标准曲线Fig.6 Standard curve of β-carotene

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验

精密移取同一β-胡萝卜素对照溶液6份，于450 nm处测定吸光度。测得6份对照溶液吸光度的RSD为0.19%，表明紫外分光光度计的精密度良好。

2.5.2 稳定性实验

精密称取炮仗花粉末约10 mg，制备供试溶液，分别在0 min、5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min于450 nm处测定吸光度。测得60 min内RSD 为0.59%，表明炮仗花类胡萝卜素在60 min内稳定性良好。

2.5.3 重复性实验

精密称取炮仗花粉末6份，每份约10 mg，制备供试溶液，于450 nm处测定吸光度。测得吸光度的RSD为0.74%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率实验

精密称取炮仗花粉末9份，每份约10 mg，分别置于100 mL 棕色具塞三角烧瓶中，分为3组，每份样品中精密加入一定量β-胡萝卜素对照品，制备供试品溶液，在450 nm处测定吸光度，计算加样回收率，结果见表1。

从表1可以看出，平均加样回收率为100.08%，RSD为1.46%，表明该方法准确度良好。

2.6 含量测定

精密称定炮仗花粉末约10 mg，共3 份，制备供试溶液，450 nm处测定吸光度，计算炮仗花类胡萝卜素含量，结果见表 2。

表1 加样回收率结果(n=9)

Tab.1 Results of adding standard recovery(n=9)

表2 含量测定结果(n=3)

Tab.2 Determination results of content

从表2可以看出，炮仗花类胡萝卜素平均含量为31.77 μg·mg-1，RSD为0.66%。

2.7 抗炎活性研究

炮仗花类胡萝卜素的抗炎活性见图7。

从图7a可以看出，炮仗花提取物在10～200 μg·mL-1范围内显示出弱细胞毒性，浓度为50 μg·mL-1时，细胞存活率最低；之后随着浓度增加，细胞存活率略微升高。从图7 b可以看出，LPS组NO含量远高于空白对照组(P<0.001)，提示抗炎模型构建成功；用炮仗花提取物预处理RAW264.7巨噬细胞后，LPS诱导产生NO受到抑制，其抑制能力呈剂量依赖性。以上结果表明，炮仗花提取物具有一定的抗炎活性，有关其抗炎机理及活性成分组成，有待于进一步研究。

**:P<0.01,与LPS处理组比较;***:P<0.001,与LPS处理组比较

2.8 讨论

2.8.1 影响因素

类胡萝卜素易氧化降解，并光、热、酸敏感，容易变质。在实验过程中，提取溶剂中加入少量BHT可延缓类胡萝卜素氧化降解。同时，应避光、低温操作，以减少实验误差。

2.8.2 类胡萝卜素含量测定

含量测定结果显示，炮仗花类胡萝卜素含量为31.77 μg·mg-1，说明炮仗花中含有一定量的类胡萝卜素，可以作为天然类胡萝卜素资源加以开发利用。另外分光光度法测定炮仗花类胡萝卜素含量操作简便、准确度高、重复性好，可以作为评价炮仗花橙色素质量的检测方法。

2.8.2 炮仗花干燥温度的考察

考察了冷冻干燥和烘干两种方式，以及烘干温度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃)对炮仗花中类胡萝卜素含量的影响。结果表明，60 ℃烘干得到的炮仗花样品测得的类胡萝卜素含量最高。冷冻干燥法所得样品为鲜艳的橙黄色，但在保存条件下会慢慢退去，推测可能发生酶解反应，使得其内色素发生降解。

3 结论

采用超声波辅助法提取炮仗花类胡萝卜素，采用分光光度法测定炮仗花类胡萝卜素含量，并通过红外光谱对炮仗花类胡萝卜素结构进行表征。利用脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型评价提取物抗炎活性。结果表明，最佳提取方法为：以20 mL无水乙醇为提取溶剂，超声波辅助提取20 min。β-胡萝卜素浓度(x)在0.996～3.486 μg·mL-1范围内与吸光度(y)线性关系良好，其线性回归方程为y=0.1461x-0.0207，R2=0.9999(n=6)，精密度RSD为0.19%，稳定性RSD为0.59%，重复性RSD为0.74%，平均加样回收率为100.08%，RSD为1.46%(n=9)，测得炮仗花类胡萝卜素含量为31.77 μg·mg-1。抗炎活性实验表明，炮仗花类胡萝卜素在高浓度时呈一定细胞毒性，且浓度依赖性抑制NO生成，具有一定的抗炎活性。