海洋真菌Aspergillus fumigatus YK-7次级代谢产物的研究

钱诗筠，刘 涛，华会明，王 宇*

(1.中国医科大学药学院，辽宁 沈阳 110122；2.沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳110016)

海洋真菌次级代谢产物已成为寻找新天然产物及新药先导化合物的重要资源[1]。目前已经从海洋真菌中发现了多种结构新颖且具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等生物活性的次级代谢产物[2-3]。作者对海洋真菌AspergillusfumigatusYK-7次级代谢产物进行研究，从该菌株的菌丝体及发酵液提取物中分离纯化得到化合物，并对部分化合物进行体外抗肿瘤活性测试，以期发现结构新颖的抗肿瘤活性代谢产物。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

ODS柱色谱填料、YMC ODS-AM色谱柱(10 mm × 250 mm，5 μm)，日本YMC公司；Sephadex LH-20，英国GE Healthcare公司；柱色谱和薄层色谱用硅胶，青岛海洋化工有限公司。

常规用试剂，分析纯或色谱纯，市售。

Bruker ARX-300型、Bruker AV-600型核磁共振波谱仪(TMS内标)，瑞士Bruker公司； Hitachi L2130型高效液相色谱仪、L2400型紫外检测器，日本Hitachi公司；Agilent 1100 SL型质谱仪，美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定与发酵

菌株鉴定：菌株YK-7分离自营口环渤海湾海域潮间带的海泥样品，经ITS测序鉴定为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。

菌株发酵：配制发酵培养基(酵母膏3 g，玉米浆1 g，甘露醇20 g，味精10 g，麦芽糖20 g，葡萄糖10 g，KH2PO40.5 g，MgSO4· 7H2O 0.3 g，CaCO32 g，陈海水1 000 mL，pH值 6.5)。摇床培养，转速为165 r · min-1，温度28 ℃，发酵培养7 d。

1.2.2 提取分离

发酵液45 L经过滤得到菌丝体与上清发酵液。菌丝体用丙酮超声提取(1 h×3)，合并提取液，减压回收得丙酮提取物250.0 g。上清发酵液浓缩后分别用等量的乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，减压回收得各层浸膏21.0 g、34.0 g。乙酸乙酯萃取物21.0 g应用硅胶柱色谱以三氯甲烷-甲醇[(100∶0 )～(0∶100)]溶剂系统梯度洗脱得到17个流分(Fr.1～Fr.17)。Fr.2经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮)及ODS柱色谱(甲醇-水)分离，得到化合物Ⅴ(12 mg)；Fr.3经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮)及重结晶纯化，得到化合物Ⅲ(10 mg)；Fr.6经ODS柱色谱(甲醇-水)及Sephadex LH-20柱色谱分离得到化合物Ⅶ(7 mg)；Fr.10经ODS柱色谱(甲醇-水)及硅胶柱色谱分离得到化合物Ⅸ(8 mg)；Fr.11经ODS柱色谱(甲醇-水)分离得到化合物Ⅳ(8 mg)；Fr.12经ODS柱色谱(甲醇-水)分离得到化合物Ⅷ(5 mg)。丙酮提取物250.0 g应用硅胶柱色谱以三氯甲烷-甲醇[(100∶0 )～(0∶100)]溶剂系统梯度洗脱得到14个流分(Fr.1～Fr.14)。Fr.2经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮)及ODS柱色谱(甲醇-水)分离，得到化合物Ⅰ(12 mg)；Fr.3经ODS柱色谱(甲醇-水)及硅胶柱色谱纯化得到化合物Ⅹ(15 mg)；Fr.5经ODS柱色谱(甲醇-水)、硅胶柱色谱及HPLC分离得到化合物Ⅱ(7 mg)、Ⅵ(6 mg)。

1.2.3 结构鉴定

对分离得到的10个化合物进行核磁与质谱测试，进行数据分析并结合理化常数鉴定化合物的结构。

1.2.4 体外抗肿瘤活性测试

应用台盼蓝法和MTT法对化合物Ⅲ～Ⅴ、Ⅸ进行了人单核细胞白血病细胞株U937和人前列腺癌细胞株PC-3体外抗细胞增殖活性测试。

2 结果与讨论

2.1 化合物结构的鉴定结果

化合物Ⅰ：无色针晶(甲醇)。1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：6.50(1H,d,J=8.5 Hz,H-7)，6.24(1H,d,J=8.5 Hz,H-6)，5.20(1H,dd,J=15.5 Hz、7.8 Hz,H-22)，5.16(1H,dd,J=15.5 Hz、7.8 Hz,H-23)，3.97(1H,m,H-3)，1.00(3H,d,J=6.6 Hz,H-21)，0.90(3H,d,J=6.6 Hz,H-28)，0.88(3H,s,H-19)，0.83(3H,d,J=6.6 Hz,H-27)，0.82(3H,s,H-18)，0.81(3H,d,J=6.6 Hz,H-26)。13CNMR(150 MHz,CDCl3)，δ：135.4(C-22)，135.2(C-6)，132.3(C-23)，130.7(C-7)，82.1(C-5)，79.4(C-8)，66.4(C-3)，56.2(C-17)，51.6(C-14)，51.0(C-9)，44.5(C-13)，42.7(C-24)，39.7(C-20)，39.3(C-12)，36.9(C-4,10)，34.7(C-1)，33.0(C-25)，30.1(C-2)，28.6(C-16)，23.4(C-11)，20.9(C-21)，20.6(C-15)，19.9(C-27)，19.6(C-26)，18.2(C-19)，17.5(C-28)，12.8(C-18)。以上数据与文献[4]报道的5α,8α-过氧-(22E,22R)-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇 [5α,8α-epidioxy-(22E,22R)-ergosta-6,22-diene-3β-ol]基本一致。

化合物Ⅱ：无色针晶(甲醇)。1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：5.20(2H,m,H-22,23)，4.23(1H,br.s,H-6)，3.94(1H,m,H-3)，3.31(1H,m,H-7)，1.14(3H,s,H-19)，1.02(3H,d,J=6.6 Hz,H-21)，0.91(3H,d,J=6.6 Hz,H-28)，0.85(3H,d,J=6.3 Hz,H-27)，0.82(3H,d,J=6.3 Hz,H-26)，0.59(3H,s,H-18)。13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：135.5(C-22)，134.4(C-9)，132.0(C-23)，126.9(C-8)，68.6(C-3)，67.1(C-6)，65.6(C-5)，62.6(C-7)，53.6(C-17)，49.6(C-14)，42.8(C-24)，42.1(C-13)，40.4(C-20)，39.1(C-4)，38.0(C-10)，35.6(C-12)，33.1(C-25)，30.8(C-2)，30.2(C-1)，29.0(C-16)，23.8(C-11)，23.4(C-15)，22.8(C-19)，20.9(C-21)，19.9(C-27)，19.6(C-26)，17.6(C-28)，11.3(C-18)。以上数据与文献[5]报道的(22E,24R)-麦角甾-8,22-二烯-3β,5α,6β,7α-四醇 [(22E,24R)-ergosta-8,22-diene-3β,5α,6β,7α-tetraol]基本一致。

化合物Ⅲ：无色针晶(乙酸乙酯-甲醇)。1HNMR(600 MHz,DMSO-d6)，δ：8.31(1H,br.s,1-NH)，7.59(1H,d,J=7.9 Hz,H-4)，7.39(1H,d,J=8.2 Hz,H-7)，7.23(1H,dd,J=8.2 Hz、7.3 Hz,H-6)，7.14(1H,dd,J=7.9 Hz、7.3 Hz,H-5)，7.09(1H,d,J=1.6 Hz,H-2)，5.75(1H,br.s,10-NH)，4.37(1H,dd,J=10.9 Hz、3.5 Hz,H-9)，4.08(1H,t,J=7.7 Hz,H-12)，3.76(1H,dd,J=15.1 Hz、3.5 Hz,H-8b)，3.65(1H,m,H-15b)，3.59(1H,m,H-15a)，2.97(1H,dd,J=15.1 Hz、10.9 Hz,H-8a)，2.32(1H,m,H-13b)，2.02(2H,m,H-13a，H-14b)，1.90(1H,m,H-14a)。13CNMR(150 MHz,DMSO-d6)，δ：169.5(C-11)，165.7(C-17)，136.8(C-7a)，126.8(C-3a)，123.5(C-2)，122.9(C-6)，120.1(C-5)，118.6(C-4)，111.7(C-7)，110.1(C-3)，59.4(C-9)，54.7(C-12)，45.6(C-15)，28.4(C-13)，27.0(C-8)，22.8(C-14)。以上数据与文献[6]报道的环(脯-色)二肽 [cyclo(Pro-Trp)]基本一致。

化合物Ⅳ：无色针晶(甲醇)。1HNMR(300 MHz,DMSO-d6)，δ：7.99(1H,s,4-NH)，7.88(1H,s,1-NH)，7.14～7.31(5H,m,H-10-H-14)，4.85(1H,t,J=5.6 Hz,7-OH)，4.04(1H,m,H-3)，3.65(1H,m,H-6)，3.28(1H,m,H-7b)，3.09(1H,dd,J=13.5 Hz、6.1 Hz,H-8b)，2.97(1H,dd,J=13.5 Hz、4.8 Hz,H-8a)，2.86(1H,m,H-7a)。以上数据与文献[7]报道的环(苯丙-丝)二肽 [cyclo(Phe-Ser)]基本一致。

化合物Ⅴ：无色针晶(甲醇)。1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：12.41(1H,s,8-OH)，7.49(1H,dd,J=8.3 Hz、7.3 Hz,H-6)，7.02(1H,d,J=7.3 Hz,H-5)，6.92(1H,d,J=8.3 Hz,H-7)，4.91(1H,m,H-4)，3.00(1H,ddd,J=17.8 Hz、8.3 Hz、4.8 Hz,H-2b)，2.65(1H,ddd,J=17.8 Hz、8.2 Hz、4.7 Hz,H-2a)，2.34(1H,m,H-3b)，2.20(1H,m,H-3a)，2.01(1H,br.s,4-OH)。13CNMR(150 MHz,CDCl3)，δ：204.4(C-1)，162.8(C-8)，146.0(C-4a)，137.1(C-6)，117.9(C-5)，117.5(C-7)，115.4(C-8a)，67.8(C-4)，34.7(C-2)，31.3(C-3)。以上数据与文献[8-9]报道的4,8-二羟基-α-四氢萘酮(4,8-dihydroxy-α-tetralone)基本一致。

化合物Ⅵ：无色油状物。1HNMR(600 MHz,CDCl3)，δ：6.24(2H,s,H-2，H-6)，6.17(1H,s,H-4)，4.86(2H,br.s,3-OH，5-OH)，2.24(3H,s,H-7)。以上数据与文献[10]报道的苔黑酚(orcinol)基本一致。

化合物Ⅶ：无色针晶(甲醇)。1HNMR(300 MHz,DMSO-d6)，δ：6.15(1H,d,J=2.0 Hz,H-5)，6.10(1H,d,J=2.0 Hz,H-3)，2.38(3H,s,H-8)。13CNMR(75 MHz,DMSO-d6)，δ：173.3(C-7)，164.5(C-4)，161.9(C-2)，142.9(C-6)，110.9(C-5)，105.1(C-1)，100.5(C-3)，23.5(C-8)。以上数据与文献[11]报道的苔黑酚羧酸(orsellinic acid)基本一致。

化合物Ⅷ：无色针晶(甲醇)。1HNMR(300 MHz,DMSO-d6)，δ：12.34(1H,br.s,-COOH)，9.45(2H,br.s,3-OH，4-OH)，7.31(1H,d,J=1.8 Hz,H-2)，7.27(1H,dd,J=8.1 Hz、1.8 Hz,H-6)，6.76(1H,d,J=8.1 Hz,H-5)。以上数据与文献[12]报道的原儿茶酸(protocatechuic acid)基本一致。

化合物Ⅸ：白色无定形粉末。ESI-MS，m/z：436.1[M+Na]+。1HNMR(300 MHz,pyridine-d5)，δ：9.74(1H,d,J=7.7 Hz,NH)，6.32(1H,m,H-7)，6.02(1H,dd,J=15.2 Hz、5.0 Hz,H-6)，5.77(1H,dd,J=7.7 Hz、4.2 Hz,H-2)，5.23(1H,dd,J=8.3 Hz、5.0 Hz,H-5)，4.97(1H,br.s,H-3)，4.79(1H,dd,J=8.3 Hz、1.8 Hz,H-4)，3.81(1H,m,H-14)，2.10(3H,s,2-NHAc)，0.82(3H,t,J=6.6 Hz,20-CH3)。13CNMR(75 MHz,pyridine-d5)，δ：175.7(C-1)，170.8(2-NHAc)，133.6(C-7)，128.7(C-6)，86.2(C-4)，70.9(C-14)，70.5(C-5)，70.0(C-3)，56.3(C-2)，22.9(2-NHAc)。以上数据与文献[13-14]报道的2-acetylamino-3,5,14-trihydroxyicos-6-en-4-olide基本一致。

化合物Ⅹ：无色油状物。ESI-MS，m/z：393.2[M+K]+。1HNMR(300 MHz,CDCl3)，δ：5.35(4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13)，4.16(2H,m,H-1′)，3.92(1H,m,H-2′)，3.69(1H,dd,J=11.4 Hz、3.6 Hz,H-3′b)，3.58(1H,dd,J=11.4 Hz、5.8 Hz,H-3′a)，2.76(2H,t,J=5.9 Hz,H-11)，2.34(2H,t,J=7.4 Hz,H-2)，2.03(4H,m,H-8，H-14)，0.87(3H,t,J=6.7 Hz,H-18)。13CNMR(75 MHz,CDCl3)，δ：174.5(C-1)，130.4,130.1,128.2,128.0(C-9，C-10，C-12，C-13)，70.4(C-2′)，65.3(C-1′)，63.5(C-3′)，34.3(C-2)，27.3(C-8，C-14)，25.8(C-11)，25.0(C-3)，14.2(C-18)。以上数据与文献[15]报道的1-单亚油酸甘油酯(1-monolinolein)基本一致。

化合物Ⅰ～Ⅹ的结构式见图1。

图1 化合物Ⅰ～Ⅹ的结构式Fig.1 Structural formulas of compound Ⅰ-Ⅹ

2.2 体外抗肿瘤活性测试结果

应用台盼蓝法和MTT法测试体外抗肿瘤活性，结果表明，化合物Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ对人单核细胞白血病细胞株U937细胞具有较弱的生长抑制活性，IC50值分别为83.9 μmol · L-1、69.0 μmol · L-1、62.0 μmol · L-1。测试的化合物对人前列腺癌细胞株PC-3细胞均未表现出抑制活性。

3 结论

从海洋真菌AspergillusfumigatusYK-7菌丝体及发酵液提取物中共分离得到10个化合物，通过核磁与质谱数据分析，结合理化常数鉴定化合物的结构，分别为：5α,8α-过氧-(22E,22R)-麦角甾-6,22-二烯-3β-醇(Ⅰ)、(22E,24R)-麦角甾-8,22-二烯-3β,5α,6β,7α-四醇(Ⅱ)、环(脯-色)二肽(Ⅲ)、环(苯丙-丝)二肽(Ⅳ)、4,8-二羟基-α-四氢萘酮(Ⅴ)、苔黑酚(Ⅵ)、苔黑酚羧酸(Ⅶ)、原儿茶酸(Ⅷ)、2-acetylamino-3,5,14-trihydroxyicos-6-en-4-olide(Ⅸ)、1-单亚油酸甘油酯(Ⅹ)。其中，化合物Ⅸ为新天然产物，化合物Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅹ从曲霉属真菌中首次分离得到，化合物Ⅳ、Ⅵ从该种真菌中首次分离得到。化合物Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ对选定的人肿瘤细胞具有一定的体外抗增殖活性。