高效氯氟氰菊酯的微生物降解研究进展

王晓慧，商文贤，徐宏英，张智清

(太原科技大学环境与安全学院，山西 太原030024)

拟除虫菊酯是天然除虫菊素的衍生化合物，因其较低的毒性、良好的稳定性，杀虫谱广，对哺乳动物安全性高，被广泛应用于公共卫生和农业领域。拟除虫菊酯进入环境后会在固相、液相、气相中循环，过度使用会污染陆地和水生环境，也会对非目标生物造成影响[1-2]。其中，高效氯氟氰菊酯是新一代Ⅱ型广谱高效拟除虫菊酯杀虫剂，毒性更强，药效更快。它具有神经毒性，通过干扰钠通道作用于昆虫的神经系统，并破坏神经元而达到除虫效果[3]。高效氯氟氰菊酯过去被认为具有对非靶标生物具有低毒、易被人体内氧化酶系统降解、不积累、低毒等特点。但研究表明，高效氯氟氰菊脂具有脂溶性，含有α-氰基-3-苯氧基苯甲醇和含有卤素基团羧酸部分，吸入后很容易从呼吸道吸收，口服后也容易在胃肠道吸收[4]。频繁过量地使用高效氯氟氰菊酯会增加非靶标生物的环境风险，会对生物的运动系统、生殖系统、呼吸系统、免疫系统等造成损害[5-7]。高效氯氟氰菊酯在自然光照射下具有光稳定性，并且对植物和微粒有很强的吸附亲和力[8]，容易在环境中大量残留。微生物降解效率高，成本低，生态恢复良好，环境友好，无二次污染，在农药降解方面有很好的前景和优势[9-10]，是修复高效氯氟氰菊酯残留的主要方法[11]。作者综述了高效氯氟氰菊酯在土壤和农作物中的残留现状及其微生物降解的研究进展。

1 高效氯氟氰菊酯的残留现状

1.1 高效氯氟氰菊酯在土壤中的残留动态

高效氯氟氰菊酯在土壤中的高疏水性和持久性，使其在土壤中迁移和大量残留，会对土壤的生态功能、菌群结构、生态平衡造成影响。郑钊等[12]研究了功夫菊酯在海南沙土和壤土的残留动态：好氧条件下，在沙土中的半衰期(T1/2)为115.52 d，壤土中的T1/2为99.02 d；厌氧条件下，沙土中的T1/2为49.51 d，壤土中的T1/2为30.13 d，表明高效氯氟氰菊酯在壤土中的降解较好，且厌氧条件下降解速度比好氧条件下快。杜红霞等[13]以济南、太原及杭州三地为试验点，测定了高效氯氟氰菊酯在梨园土壤中的T1/2、安全施用剂量：在土壤中的T1/2为2.6～23.1 d，太原点和杭州点低于济南点，且2.5%的高效氯氟氰菊酯的安全施用剂量为12.5 g a.i.·hm-2。李宏宇等[14]研究了杭州、乌鲁木齐安宁渠的高效氯氟氰菊酯在大白菜土壤中的残留动态：T1/2为9.0～11.9 d，乌鲁木齐安宁渠的土壤残留量稍低于杭州。乌鲁木齐安宁渠土壤偏碱性，试验时间在夏季；杭州的土壤偏酸性，试验时间在冬季；表明高效氯氟氰菊酯更易在碱性、温度比较高的环境下降解。研究人员[15-17]同时测定了白菜、玉米和小麦土壤中高效氯氟氰菊酯的残留，在玉米土壤中的T1/2为19.6～28.1 d，在小麦土壤中的T1/2为16.5～19.3 d，而在小白菜土壤中降解迅速，T1/2为8.3～13.4 d，发现高效氯氟氰菊酯在玉米土壤中降解较慢。可见，土壤的类型、酸碱度、通气量、温度、时间、农作物种类等均会影响高效氯氟氰菊酯在土壤中的降解。

1.2 高效氯氟氰菊酯在蔬菜、水果及农作物中的残留动态

高效氯氟氰菊酯可有效防治蔬菜、水果及农作物上多种害虫，但大量或不规范的施用，会造成农药在果蔬和农作物中的残留，最终通过食物链在人体内累积，威胁人类健康。山西韭菜农残检测显示，农药总检出率为80%，其中高效氯氟氰菊酯检出率为16.7%[18]；广西荔枝主产区农残现状的调查表明，高效氯氟氰菊酯的检出率为20.4%，超标率为0.02%[19]；北京市蔬菜农残状况调查显示，高效氯氟氰菊酯超标率为0.2%，韭菜根部农药残留明显[20]；杭州市蔬菜农残现状表明，拟除虫菊酯类农药的总检出率为12.6%，总超标率为2.1%，高效氯氟氰菊酯的检出率最高[21]；李琰等[22]对上海市闵行区市场果蔬农残情况作了分析，高效氯氟氰菊酯检出率最高，其残留量最高的蔬菜、水果分别为鸡毛菜和苹果；王冬群等[23]对蔬菜中拟除虫菊酯的残留情况进行了调查，其中豌豆中高效氯氟氰菊酯的超标率为25%；徐晶等[24]抽检了哈尔滨市的17家超市蔬菜样品，发现菊酯类农药总检出率为12.67%，超标率为2.98%，高效氯氟氰菊酯检出率为12.5%，叶类蔬菜问题最多。郝宁等[25]调查了2010～2013年邯郸市蔬菜中的拟除虫菊酯残留，8种拟除虫菊酯的总检出率为18.62%，高效氯氟氰菊酯的检出率最高，农药主要集中在鳞茎类、叶茎类、豆类蔬菜中。

综上，我国高效氯氟氰菊酯的残留和超标现象较为普遍，由于其对光和热的稳定性，在环境中有很长的半衰期，它引起的一些生物慢性毒性、致癌致突变性严重威胁人类健康[26-28]。

2 高效氯氟氰菊酯降解菌

我国是一个生物资源大国，微生物物种、代谢和生态类型丰富多样，自然环境中存在着大量的细菌、放线菌、真菌及藻类等微生物，为菌株的筛选提供了充足的资源。从长期高浓度农药污染土壤中筛选高效降解菌株，再与土著微生物群落共同作用降解农药残留，是修复污染土壤的有效途径[29]，微生物功能的生物修复是国际土壤修复科学中的热点内容[30]。

目前，研究人员已经分离到大量的拟除虫菊酯类农药降解菌株，见表1[31-39]。有关高效氯氟氰菊酯降解菌的研究也不少，见表2。

王彦辉等[40]筛选到一株高效降解真菌，经鉴定为青霉菌(Penicilliumsp.)，菌株在pH=7.0、30 ℃、底物浓度为50 mg·L-1时降解效果最好，在此条件下培养7 d，功夫菊酯降解率可达到83.90%。刘珍[41]分离筛选到两株真菌，为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)和草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，在28 ℃、接种量为5%的条件下培养5 d后，两株真菌对100 mg·L-1功夫菊酯的降解率分别为69.89%和84.83%。张建等[42]分离到一株对功夫菊酯有高效降解作用的细菌，鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，它的最适生长温度、pH值分别为30 ℃、7，底物浓度为100 mg·L-1时，3 d对功夫菊酯的降解率为85%。徐莲等[43]分离到一株三氟氯氰菊酯高效降解细菌，为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，该菌株最适生长温度、pH值分别为30 ℃、8～9，具有耐盐性，底物浓度为100 mg·L-1时，1 d降解率可达到98.4%，且对三氟氯氰菊酯的耐受性极强，可以达到600 mg·L-1。翟逸[44]分离到一株人苍白杆菌(Ochrobactrumanthropi)，菌株在30 ℃、pH=7.0、2.0%接种量、高效氯氟氰菊酯浓度50 mg·L-1时，降解率为84%，耐受能力强，对高效氯氟氰菊酯耐受浓度可达到400 mg·L-1，且该菌株对其中间代谢产物3-苯氧基苯甲酸能有效降解，使残留被彻底清除。王琨[49]筛选到3株高效氯氟氰菊酯降解菌，菌株BE-1降解率最高，在30 ℃、pH值7.0、初始浓度为100 mg·L-1时，降解率为49.6%。吴浩豪等[45]筛选到一株鞘氨醇杆菌属(Sphingobacteriumsp.)，对氯氟氰菊酯有降解作用，该菌株的最适温度、pH值分别为30 ℃、7.0，菌株有很宽的pH值适用范围，在pH值5～9的条件下，对氯氟氰菊酯的降解率都可以达到50%以上，底物浓度为200 mg·L-1时，7 d降解率可以达到77.2%。肖红利[46]分离得到一株不动杆菌(Acinetobactersp.)，最适温度、pH值分别为28 ℃、7.0，具有广谱性，能以拟除虫菊酯、有机磷等多种农药为碳源，且对农药的耐受浓度高达500 mg·L-1，菌株在28 ℃、180 r·min-1培养108 h，对200 mg·L-1三氟氯氰菊酯降解率为77.8%。虞云龙等[47]分离到一株产碱菌属(Alcaligenes)的一个未知种，该菌株最适温度、pH值分别为30 ℃、7.0～7.5，该菌株具有广谱性，对三氟氯氰菊酯有降解作用，50 mg·L-1的三氟氯氰菊酯降解速率为3.04 μmol·L-1·h-1。目前筛选到的能降解高效氯氟氰菊酯菌株降解能力强，有广谱性，大多是细菌，少量为真菌，很少筛到放线菌。细菌对环境适应能力强，在高浓度农药的作用下，易发生突变，在农药的微生物降解中起主导作用[50]。

表1 降解拟除虫菊酯的微生物类群

Tab.1 The microbe group for degrading pyrethriods

表2 降解高效氯氟氰菊酯的微生物类群

Tab.2 The microbe group for degrading lambda-cyhalothrin

3 高效氯氟氰菊酯的降解酶和降解基因

农药降解酶主要来自于微生物。微生物的降解实质是酶促反应，是微生物通过物理或化学方法，产生水解酶和各类氧化酶将农药分解转化的过程。酯酶在拟除虫菊酯的降解中具有重要的调节作用[51]。降解酶通常比降解菌更能忍耐极端环境，不受温度、pH值、土著微生物吞噬、农药浓度等外部环境的影响，环保安全，降解谱广，降解效率高。当前拟除虫菊酯降解酶的研究主要集中在提取、纯化粗酶液以及酶学性质方面。林淦[48，52]从阴沟肠杆菌W-1中提取的粗酶液，可以水解氯氟氰菊酯，反应速率最大为63.93 nmol·mL-1·min-1，氯氟氰菊酯在浓度为20 mg·L-1、35 ℃、pH值7.5时，粗酶液在1 h的降解率可以达到83%，且该粗酶液的胞内酶表现出降解底物的活性。解开治等[53]从恶臭假单胞菌XP12中提取粗酶液，在pH值6.5～8.0、25～40 ℃时对高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率均在70%左右，将粗酶液用于叶类蔬菜上，其对高效氯氟氰菊酯降解率可达到83.5%，起催化降解作用的是胞内酶。虞云龙等[54]从广谱性产碱菌中提取了粗酶液，该粗酶液在pH值5.0～10.5范围内均有较好的降解活性，有广谱性，能降解部分拟除虫菊酯，降解三氟氯氰菊酯的最适pH值为7.5，米氏常数为8.67 mmol·L-1，最适温度为32.5 ℃，胞内酶对拟除虫菊酯农药起降解作用。拟除虫菊酯农药酶促降解的研究表明，降解酶具有更高的降解率，且对温度和pH值有更宽的适应性，在实际应用中有很好的前景，对农药降解起主要作用的是胞内酶。也有研究人员发现，胞外酶对降解拟除虫菊酯农药起作用，徐莲等[43]从能高效降解三氟氯氰菊酯的芽孢杆菌中提取能降解三氟氯氰菊酯的粗酶液，酶的定域试验和底物诱导试验表明，该降解酶为组成型胞外酶，粗酶液反应温度为30～60 ℃，在温度和pH值分别为40 ℃、9.0时有最高降解活性，60 ℃时酶的活性保持在50%左右；且发现其降解基因在染色体的DNA上，不在质粒上。郭鹏[55]对一株能高效降解甲氰菊酯的范氏鞘酯菌JZ-2进行深入研究，并且通过硫酸铵沉淀、凝胶层切和切胶回收电洗脱等纯化粗酶液，获得了一个新的菊酯水解酶PytH，该酶属组成型胞内酶，在温度为25～50 ℃、pH值为6.0～8.5时，均对酶的活性没有影响，该酶的最大降解速率和米氏常数分别为7.536 nmol·min-1、0.05 nmol·mL-1，纯化的水解酶有广谱性，对其它拟除虫菊酯也有水解作用。

从筛选到的高效降解菌株中分离到的酶含量低，且酶的分离纯化费时、费力、成本高。通过克隆酶的降解基因并进行异源表达可以提高酶的产量。关于拟除虫菊酯克隆基因的报道还很少，仅克隆到几个降解基因，即estP水解酶基因(克雷伯氏菌ZD112)、pytH水解酶基因(鞘酯菌JZ-1)、pye3水解酶基因[56-58]。肖红利[46]从不动杆菌属菌中克隆了氯氰菊酯降解酶片段(约5 kb)，并在大肠杆菌E.coliBL21中进行了表达，应用分子生物学技术构建了4-D菌株基因组文库，从中得到的重组质粒对高效氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯有良好降解性，重组质粒中可能有拟除虫菊酯降解基因，有待进一步的研究。翟逸[44]构建了人苍白杆菌YZ-1的基因组文库，从中克隆了一个新型的酯酶基因pytZ，它与已知的几个拟除虫菊酯水解基因序列相似性极低，pytZ有一个606 bp的开放阅读框，用来编码拟除虫菊酯水解羧酸酯酶；转入大肠杆菌系统中诱导纯化获得的PytZ蛋白，在温度20～45 ℃和pH值6.0～8.0范围内均可以降解高效氯氟氰菊酯，PytZ底物特异性广泛、酶活性高、稳定性好，为微生物降解拟除虫菊酯提供了有利资源。通过基因改良技术将降解酶基因转入易于繁殖的宿主中获得高表达，可增大酶产量，提高降解效率，也避免了直接使用微生物菌株存在的问题。通过基因组文库的成功构建，为高效氯氟氰菊酯降解基因的提取提供了有利条件。

4 高效氯氟氰菊酯的降解机理和途径

拟除虫菊酯类农药种类繁多，代谢途径也较为复杂，这类农药的化学式中都有酯键，其微生物降解失去神经毒素的关键就是酯键的断裂[59]。由菌株对高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯降解途径(图1～3)发现，其降解的第一步就是酯键的断裂。目前对高效氯氟氰菊酯的微生物降解机理研究较少。林淦等[48]研究了阴沟肠杆菌对高效氯氟氰菊酯的降解途径，在粗酶液作用下，水解生成α-氰基-3-苯氧基苄醇和2,2-二甲基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)环丙烷羧酸(图4)。Chen等[60]分析了苏云金芽孢杆菌对氯氟氰菊酯的降解途径，该菌株通过酯键和芳基键的断裂，产生了6种代谢产物：α-羟基-3-苯氧基苯甲酰基乙腈、3-苯氧基苯基乙腈、N-(2-异丙氧基苯基)-4-苯氧基苯甲酰胺、3-苯氧基苯甲醛、3-苯氧基苯甲酸酯和苯酚。Birolli等[61]分析了海洋真菌对(±)-氯氟氰菊酯的降解途径，首先被羧酸酯酶水解，酯键断裂，产生2-羟基-2-(3-苯氧基苯基)乙腈和2,2-二甲基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)环丙烷羟酸，2-羟基-2-(3-苯氧苯基)乙腈可以通过一种氧化腈酶(将氰醇转化为醛的酶)生成3-苯氧基苯甲醛，氰醛通过氧化生成3-苯氧基苯甲酸，最后生成3-(羟基苯氧基)苯甲酸(图5)。作为拟除虫菊酯的主要中间代谢产物3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)比母体农药更具流动性和持久性，毒性更强，它对环境及人体有潜在危害[62]。微生物对农药的降解过程中存在污染物的不完全降解，会带来二次污染，造成被修复土壤的毒性作用增强，所以研究菌株对高效氯氟氰菊酯的降解途径是很有必要的。

图1 枯草芽孢杆菌对氯氰菊酯的降解途径 Fig.1 Degradation pathway of beta-cypermethrin by Bacillus subtilis

图2 无色杆菌对溴氰菊酯的降解途径Fig.2 Degradation pathway of delta-methrin by Chromatic bacteria

图3 醋酸钙不动杆菌对联苯菊酯的降解途径Fig.3 Degradation pathway of bifenthrin by Acinetobacter acetate

图4 阴沟肠杆菌对高效氯氟氰菊酯的降解途径Fig.4 Degradation pathway of lambda-cyhalothrin by Enterobacter cloacae

图5 海洋真菌对(±)氯氟氰菊酯的降解途径Fig.5 Degradation pathway of (±)lambda-cyhalothrin by marine-derived fungi

5 结语

目前对高效氯氟氰菊酯降解菌的筛选工作，仅限于实验室条件下单一菌株的培养和降解，而从实验室到自然环境中，受到各因素的制约，实际效果不太理想，同时菌株的安全性评价有待进一步考察。筛选高效广谱、适应性强及环境友好的高效氯氟氰菊酯降解菌株，用分子生物学和基因工程等技术对降解酶基因资源进行克隆，构建高效工程降解菌，制备多菌株复合系，是解决上述问题的根本方法。

很多情况下微生物并不能将农药完全降解矿化，某些中间代谢产物的毒性大于母体化合物毒性，通过质谱等手段分析高效氯氟氰菊酯降解的中间代谢产物以推断降解途径，并深入研究菌株的降解途径对提高微生物的修复有重要作用。

关于高效氯氟氰菊酯降解酶的分离纯化和固定化研究相对较少。天然的分离菌株其产酶量较低，且酶在土壤中的活动性较差，而纯化的降解酶更能忍受异常环境，因此对降解酶进行纯化和固定化可以提高酶的稳定性和适应力，应该大力加强这方面的研究。