HPLC法测定木鳖子中对羟基苯甲酸含量

邢炎华，曲倩柔，高婉娜

(1.陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药绿色制造技术协同创新中心，陕西 咸阳 712046)

木鳖子为葫芦科木鳖Momordicacochinchinensis(Lour.) Spreng.的干燥成熟种子，味苦，微甘、凉，有毒，具有散结消肿和攻毒疗疮的功效，常用于治疗疮疡肿毒、乳痈、瘰疬、痔漏、干癣和秃疮等[1-2]。目前关于木鳖子的研究虽然较多，但与化学成分相关的报道较少。李晓波团队[3]和巢志茂团队[4]对木鳖子脂溶性部分进行了分离，得到部分物质并对这些物质进行了鉴定与确认，其中李晓波团队从木鳖子脂溶性部分分离得到对羟基苯甲酸。作者参照文献[5-7]，采用HPLC法对木鳖子中对羟基苯甲酸进行确认，并对其含量进行测定。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

木鳖子药材(批号:150601)，购于陕西康盛堂药业有限公司，经陕西国际商贸学院医药学院中药教研室鉴定为葫芦科植物木鳖Momodicacochinchinensis(Lour.) Spreng.的干燥成熟种子。

甲醇，冰乙酸，石油醚(60～90 ℃)，对羟基苯甲酸(分析纯)。

Waters e2695型高效液相色谱仪、Waters 2489型紫外检测器，Waters；BT125D型分析天平，赛多利斯；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KH5200DE型超声清洗器，杭州法兰特超声波科技有限公司。

1.2 对羟基苯甲酸对照溶液的制备

精密称取对羟基苯甲酸0.20 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得20 μg·mL-1对羟基苯甲酸对照储备溶液。精密量取上述溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得2 μg·mL-1对羟基苯甲酸对照溶液。

1.3 样品溶液的制备

取20 g木鳖子药材(去壳)粗粉，置于卷好的滤纸筒中；将密封好的滤纸筒装入索氏提取器中，用10倍量的石油醚(60～90 ℃)脱脂；脱脂后的药材挥干石油醚，加入10倍量的甲醇回流1.5 h；回流液用旋转蒸发仪回收甲醇，剩余残渣再用10 mL甲醇溶解，过滤；滤液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得样品溶液。

1.4 色谱条件

Agela Venusil XBP C18保护柱及色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相:甲醇(A)-0.1%冰乙酸(B)，梯度洗脱：0～10 min，10%A；10～30 min，10%～30%A；30～31 min，70%A；31～40 min，70%～10%A；40～45 min，10%A；检测波长254 nm；流速1 mL·min-1。

2 结果与讨论

2.1 HPLC图谱

对羟基苯甲酸对照溶液和样品溶液的HPLC图谱如图1所示。

图1 对羟基苯甲酸对照溶液(a)和样品溶液(b)的HPLC图谱Fig.1 HPLC spectra of p-hydroxybenzoic acid control solution(a) and sampel solution(b)

2.2 分析方法的评价

2.2.1 方法适应性

取样品溶液20 μL，按色谱条件进行分离。结果显示，HPLC法能够很好地分离样品溶液中的对羟基苯甲酸，拖尾因子为0.967，分离度为1.75，理论塔板数为126 964。

2.2.2 线性关系考察

分别取对羟基苯甲酸对照溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标、对羟基苯甲酸质量为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为y=1000000x-81274，R2=0.9997。表明，对羟基苯甲酸质量在0.100～0.485 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.2.3 精密度实验

取对羟基苯甲酸对照溶液10 μL，按色谱条件连续进样6次，记录峰面积。测得峰面积的RSD为1.92%，表明仪器的精密度良好。

2.2.4 稳定性实验

分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取样品溶液20 μL，按色谱条件进样测定。测得6个时间段对羟基苯甲酸含量的RSD为1.69%，表明样品溶液在24 h内具有较好的稳定性。

2.2.5 重复性实验

取3份同一批的木鳖子药材(去壳)粗粉分别制成样品溶液，按色谱条件连续进样2次，每次20 μL。测得对羟基苯甲酸含量的RSD为4.44%，表明该方法的重复性满足要求。

2.2.6 加标回收率实验

取3份同一批的木鳖子药材(去壳)粗粉分别制成样品溶液，各取600 μL置于1 mL容量瓶中，精密加入300 μL 2 μg·mL-1对羟基苯甲酸对照溶液，用甲醇定容至刻度，按色谱条件连续进样2次，每次10 μL，计算加标回收率，结果见表1。

表1 加标回收率

Tab.1 Adding standard recovery

由表1可知，平均加标回收率为107.5%，RSD为2.25%，表明该方法回收率良好。

2.3 含量测定

取3份木鳖子药材(去壳)粗粉分别制成样品溶液，按色谱条件进样测定，进样量为20 μL。测得3份木鳖子药材中对羟基苯甲酸含量分别为4.775 μg·g-1、5.200 μg·g-1、4.850 μg·g-1，平均含量为4.942 μg·g-1。

2.4 讨论

对羟基苯甲酸是一种广泛应用的有机化合物，是合成尼泊金类防腐剂的重要原料，在有机合成中具有重要地位。近年来，研究[8-9]发现对羟基苯甲酸具有降低植物根部细胞氧自由基活性的作用；Wang等[10]研究表明，对羟基苯甲酸能够降低阿霉素治疗乳腺癌的耐药性；张丹等[11]研究表明，木鳖子提取物具有抗氧化活性。这些研究结果提示对羟基苯甲酸可能是木鳖子提取物抗氧化作用的潜在物质之一；在木鳖子抗肿瘤方面，对羟基苯甲酸也可能有潜在的间接作用。

3 结论

采用HPLC法测定木鳖子中对羟基苯甲酸含量。色谱条件为：Agela Venusil XBP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，甲醇-0.1%乙酸为流动相进行梯度洗脱，检测波长254 nm，流速 1 mL·min-1。结果表明，木鳖子中对羟基苯甲酸分离良好，分离度为1.75，理论塔板数为126 964；对羟基苯甲酸质量(x)在0.100～0.485 μg之间与峰面积(y)线性关系良好，线性方程为y=1000000x-81274(R2=0.9997)；平均加标回收率为107.5%；木鳖子药材中对羟基苯甲酸含量为4.942 μg·g-1。木鳖子中对羟基苯甲酸的确认丰富了木鳖子中已知的化学成分，为后续的物质基础研究提供了一定的基础。