杜仲内生真菌SX2018-06发酵产松酯醇二葡萄糖苷工艺条件的优化

程 浩，王晓丽，董小婧，周志文

(江苏省肿瘤医院，江苏省肿瘤防治研究所，南京医科大学附属肿瘤医院，江苏 南京 210009)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)为杜仲科杜仲属仅存的孑遗植物，是我国国家二类保护植物[1]。杜仲是传统中药材，《神农本草经》记载“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余沥。久服，轻身耐老。”[2]杜仲中含有几十种药理活性物质，主要有木质素类、苯丙素类、环烯醚萜类以及其它萜类化合物等[3-5]。现代医学研究发现，杜仲在降低血压方面有很好的疗效，进一步研究证实杜仲中木脂素类化合物松脂醇二葡萄糖苷(PDG)是降压的主要成分[6-8]。杜仲既可以使高血压病人血压降低又可以使低血压病人血压上升，并且调节血压持久无任何其它不利影响[9]。杜仲资源珍贵稀少，生长缓慢，仅仅依靠提取手段很难满足日益增长的市场需要[10-11]。近年来研究发现，寄生于植物体内的内生真菌和寄主植物协同进化，内生真菌可以在生命活动过程中合成某些药用植物所具有的相同或相似的物质[12-13]。本课题组从徐州市选取10年树龄的杜仲树树皮，分离出能产生PDG的内生真菌8株，通过筛选获得一株产量较高的拟茎点霉属内生真菌SX2018-06，PDG产量可达18.63 mg·L-1。

作者以拟茎点霉属SX2018-06为研究对象，进行发酵工艺条件优化，以提高PDG产量，为工业化生产PDG提供理论和实践基础。

1 实验

1.1 菌种、试剂与培养基

1.1.1 菌种

拟茎点霉属(Phomopsissp.)SX2018-06，实验室保藏菌种。

1.1.2 试剂

可溶性淀粉，天津鼎盛鑫化工有限公司；玉米浆，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、麦芽糖、乳糖，分析纯，上海埃彼化学有限公司；酵母膏、蛋白胨，分析纯，青岛青药生物工程有限公司；MgSO4·7H2O、NaNO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、CuSO4、NaOH、FeSO4，分析纯，广东予能实验室设备科技有限公司；琼脂粉，分析纯，北京天马华信化工有限公司；消泡剂，食品级，上海广锐生物科技有限公司；马铃薯，市售。

1.1.3 培养基

斜面培养基(g·L-1)[14]：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，琼脂粉18.0，pH值 7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。

种子培养基(g·L-1)[15]：NaNO33.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO40.01，蔗糖 30.0，消泡剂0.1，pH值 7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。

发酵培养基(g·L-1)[16]：可溶性淀粉50.0，玉米浆10.0，NaNO32.0，K2HPO40.6，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.4，消泡剂0.1，pH 值7.0～7.2。121 ℃高压灭菌20 min。

1.2 仪器

BBS-DDC型台式超净工作台，山东博科科学仪器有限公司；SPX-80A型生化培养箱，上海恒跃医疗器械有限公司；TS-100C型恒温摇床，上海善志仪器设备有限公司；BLBIO-20SJ型机械搅拌通风式发酵罐，上海百仑生物科技有限公司；TG台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；LDZX-50KBS型高压灭菌锅，厦门森泰仪器仪表有限公司；Agilent1260型高效液相色谱仪，美国Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

将保藏的SX2018-06菌种转接到斜面培养基，30 ℃活化培养168 h。取2 cm3的SX2018-06生长旺盛的菌块，接种到250 mL含有100 mL种子培养基的三角烧瓶中，28 ℃、200 r·min-1条件下振荡培养70 h，即为种子液。

1.3.2 单因素实验

取种子液接入发酵罐，接种量为10%，设定初始pH值为6.0、发酵温度为28 ℃、通气量为5.0 L·min-1，连续发酵190 h。考察发酵温度、初始pH值、通气量、接种量等因素对SX2018-06产PDG的影响。

1.3.3 响应面实验

根据单因素实验结果，以PDG产量(Y)为响应值，以发酵温度(X1)、初始pH值(X2)、通气量(X3)、接种量(X4)为考察因子，采用Box-Behnken进行4因素3水平响应面实验设计[17-19]，SX2018-06产PDG发酵条件优化Box-Behnken实验的因子与水平见表1。

表1 SX2018-06产PDG发酵条件优化Box-Behnken实验的因子与水平

Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for optimization of fermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

1.3.4 PDG含量的测定

PDG含量测定方法参照文献[20-22]。

1.3.5 数据处理

用Design Expert 8.0.6软件对实验数据[23-24]进行线性回归和方差分析，通过SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 发酵温度对SX2018-06产PDG的影响(图1)

图1 发酵温度对SX2018-06产PDG的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on production of PDG by SX2018-06

从图1可看出，PDG产量随发酵温度的升高，呈现出先增加后下降的倒“U”型形状；在温度为28 ℃时，PDG产量最大，达到42.24 mg·L-1。分析原因可能是，SX2018-06通过代谢合成PDG过程需要一系列酶的催化，酶催化活性受温度调控。只有温度达到某一值时，酶的催化活性最大，低于或高于这个值催化活性都会降低。所以，SX2018-06产PDG的最适发酵温度为28 ℃。

2.1.2 初始pH值对SX2018-06产PDG的影响(图2)

图2 初始pH值对SX2018-06产PDG的影响Fig.2 Effect of initial pH value on production of PDG by SX2018-06

由图2可看出，初始pH值从5.0升高到7.5的过程中，PDG产量逐渐增加，当pH值达到6.5时，PDG产量达到最高；当pH值大于6.5之后，PDG产量逐渐下降。分析原因可能是，SX2018-06合成PDG的酶系在初始pH值为6.5时，有最大的催化活性。所以，SX2018-06产PDG最适初始pH值为6.5。

2.1.3 通气量对SX2018-06产PDG的影响(图3)

由图3可看出，通气量从3.0 L·min-1增加到8.0 L·min-1的过程中，PDG产量呈现先增加后下降的趋势；当通气量为7.0 L·min-1时，PDG产量最大，达到42.71 mg·L-1。分析原因可能是，SX2018-06是好氧真菌，在代谢过程中代谢的速率会随着环境中氧气的含量变化而变化。所以，SX2018-06产PDG最适通气量为7.0 L·min-1。

图3 通气量对SX2018-06产PDG的影响Fig.3 Effect of ventilation amount on production of PDG by SX2018-06

2.1.4 接种量对SX2018-06产PDG的影响(图4)

图4 接种量对SX2018-06产PDG的影响Fig.4 Effect of inoculation rate on production of PDG by SX2018-06

从图4可看出，当接种量从8%增加到13%的过程中，PDG产量呈现先增加后下降的趋势；当接种量为12%时，PDG产量最大，达到43.15 mg·L-1。分析原因可能是，接种量小时，达不到发酵的菌浓，PDG产量较小；但是当接种量过大时，发酵罐内的菌浓过大，会造成菌种之间对营养物质和发酵条件的过度竞争，从而降低PDG产量。所以，SX2018-06产PDG最适接种量为12%。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 回归模型的建立

SX2018-06产PDG发酵条件优化Box-Behnken实验结果见表2。

用统计软件Design Expert 8.0.6对实验结果进行多元回归拟合，二次多项式回归方程为：

表2 SX2018-06产PDG发酵条件优化Box-Behnken实验结果

Tab.2 Results of Box-Behnken experiment for optimization of fermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

2.2.2 回归模型的方差分析

SX2018-06产PDG发酵条件优化回归模型方差分析见表3。

表3 SX2018-06产PDG发酵条件优化回归模型方差分析

Tab.3 Variance analysis of regression model for optimization offermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

注：*表示对结果影响显著(P<0.05)；**表示对结果影响极显著(P<0.01)。

由表3可知，模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，表明回归模型的拟合度较好。

2.2.3 响应面图的分析

发酵温度、初始pH值、通气量和接种量4个影响因子两两交互作用对SX2018-06产PDG的影响的响应面及等高线见图5。

图5 不同因子交互影响PDG产量的响应面图Fig.5 Response surface maps of PDG production influenced by different factors

从图5可看出，A图、B图、C图和F图，响应面图形呈现出抛物面形状，说明4对交互因子(X1X2、X1X3、X1X4、X3X4)在实验范围内，响应值均有极大值。等高线均呈现椭圆形，也说明4对交互因子对结果影响显著，与前面方差分析的结果是一致的。

2.3 验证实验

二次多项式回归方程采用Design Expert 8.0.6软件求解， SX2018-06产PDG最优的发酵条件为：发酵温度27.69 ℃、初始pH值5.85、通气量6.26 L·min-1、接种量为12.32%，预测PDG产量为42.68 mg·L-1。根据方程的求解和实际发酵情况，确定优化的发酵条件为：发酵温度28.0 ℃、初始pH值6.0、通气量6.5 L·min-1、接种量12.5%。根据优化的发酵条件，连续做3个重复，平均PDG产量为43.28 mg·L-1，和预测值非常接近。所以，回归模型和实际情况拟合度较好。PDG产量比优化前提高了132.31%。

3 结论

对实验室筛选的产PDG的杜仲内生真菌SX2018-06进行发酵工艺条件优化，通过相应的实验设计，得到优化的发酵工艺条件为：发酵温度28.0 ℃、初始pH值6.0、通气量6.5 L·min-1、接种量12.5%，在此优化条件下，PDG产量达到43.28 mg·L-1，较优化前提高了132.31%。本研究所构模型可显著提高杜仲内生真菌SX2018-06发酵产PDG产量，为规模化生产提供了理论和实践的基础。