不同年龄分期老年AD患者APOE基因表达及其与患者认知功能障碍的关系

朱 烨， 陈 燕， 彭 乐， 江友琴

(江西省人民医院, 江西 南昌 330000)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种好发于老年群体的表现为记忆力衰退、进行性认知功能障碍的中枢神经疾病，AD已成为全球范围性的重大公共卫生问题[1]。目前，诊断AD仍以核磁共振(MRI)、X线片扫描结合患者临床表现以及神经心理学量表的综合手段为主，但因为AD的潜伏期较长，故确诊时多已造成神经功能损伤[2]。研究表明，APOE基因的表达与AD发病密切相关，且其在不同年龄段中患者的表达量不同[3]。基于此，本研究探讨了不同年龄分期老年AD患者APOE基因表达情况，并分析了其与患者认知功能障碍之间的相关性，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料:选择2018年6月至2019年6月我院收治的老年AD患者64例为主要研究对象，根据患者发病年龄分为早发型AD组(1组，<65岁)、迟发型AD组(>65岁)，迟发型AD组又分为老年期组(2组，65～80岁)、高龄期组(3组，80～90岁)、长寿期组(4组，>90岁)，每组16例。纳入标准：①符合美国国立神经病、语言交流障碍及卒中研究所-老年性痴呆及相关疾病学会(National Institute of Neurologic and Communicative Disorders and Stroke-AD and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)[4]标准；②年龄>60岁；③简易智力状态量表(Mini-Mental State Examimation,MMSE)评分≤26分，且临床痴呆评定量表(Clinical dementia rating,CDR)评分≥1分，Hachinski缺血指数<4分。排除标准：①严重颅脑损伤史患者；②抗精神疾病药物依赖患者；③其他影响中枢神经功能疾病患者；④合并严重认知功能障碍患者；⑤合并心、肝、肺、肾等器官严重功能障碍患者；⑥血液系统疾病患者。1组中男4例，女12例，年龄为60～65岁，平均为(62.63±2.64)岁；2组中男5例，女11例，年龄为66～80岁，平均为(71.85±6.04)岁；3组中男6例，女10例，年龄为81～90岁，平均为(85.89±3.70)岁；4组中男5例，女11例，年龄>90岁，平均(93.89±2.62)。4组患者的性别对比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究征得我院伦理委员会同意，患者家属知情，并签署知情同意书。

1.2方法:抽取10mL所有患者清晨空腹状态外周静脉血，EDTA管抗凝，2000r/min，离心处理10min，分离出血浆，根据Hixson等的PCR及限制性内切酶APOE基因亚型分型方法，使用红细胞裂解液分离剩余所得静脉血样本中的白细胞，用已预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次后，提取DNA进行PCR扩增。扩增引物：上游引物：5'-ACAGAATTCGC-CCCGGCCTGGTACAC-3'，下游引物：5'-TAAGCT-TGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'，PCR反应体系：1μg DNA模板、5μL反应缓冲液(10倍浓度)、200μmoL/L dNTPs、1.5mmoL/L 氯化镁(MGCl2)、10 pmoL 上游引物、10p moL下游引物、5μL 二甲基亚砜(10%)，1.5U Taq DNA聚合酶，共50μL。反应过程：95℃，变性，1min→62℃，退火，2min→72℃，延伸，2min，循环30次后→72℃，延伸，10min，反应结束。取20μL PCR扩增产物，37℃，置入5U限制性内切酶(HhaⅠ)酶进行酶切4～5h，酶切位点为GCGC，再行琼脂糖凝胶电泳，80V，电泳6～8h，再用溴化已定进行染色处理，观察并记录电泳分离条带的数量及位置，以检测APOE的不同基因亚型表达情况。

1.3观察指标:检测4组患者的APOE基因表达情况，并用简易智力状态量表(MMSE)、AD认知功能评定量表(ADAS-cog)、AD日常生活能力量表(ADL)综合评定患者的认知功能障碍程度。其中，MMSE量表包含语言能力、回忆能力、计算力及注意力、记忆力、定向力等共5个条目，总分为0～30分，≥27分为正常，<27分为认知功能障碍，≤9分为重度认知功能障碍，10～20分为中度认知功能障碍，21～26分为轻度认知功能障碍；ADAS-cog量表包含注意力、找词能力、回忆测验指令、定向力、结构性练习、命名、单次回忆、执行指令、意向性练习、词语辨认、口头语言表达、语言理解、等共12个条目，总分为0～75分，得分越高代表认知功能障碍程度越高；ADL量表共20个条目，总分为20～80分，分值越高代表日常生活能力越差。

2 结 果

2.14组患者的APOE基因表达情况比较:结果表明，4组患者均未出现E2/E2型APOE基因亚型，E3/E3亚型表达中，1组患者的频率最高，为62.50%(10/16)，其次为2组患者的43.75%(7/16)，E3/E4亚型表达中，3组患者频率最高，为43.75%(7/16)，其次为4组患者的37.50%(6/16)，其余亚型的表达均较低；APOE共E2/E3/E4 3种等位基因，其中E3的表达频率最高，其次为E4，E2表达频率最低，见表1。

表1 4组患者的APOE基因表达情况比较n(%)

注：①表示1组与2组比较检验值，①P>0.05；②表示2组与3组比较检验值，②P>0.05；③表示3组与4组比较检验值，③P>0.05;④表示1组与4组比较检验值，④P<0.05；⑤表示1组与3组比较检验值，⑤P>0.05；⑥表示2组与4组比较检验值，⑥P>0.05

2.24组患者的MMSE、ADAS-cog、ADL评分情况比较:结果表明，4组患者的MMSE、ADAS-cog、ADL评分比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，且MMSE评分中：1组>2组>3组>4组，ADAS-cog评分中：1组<2组<3组<4组，ADL评分中：1组<2组<3组<4组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 4组患者的MMSE ADAS-cog ADL评分情况比较分)

注：①表示1组与2组间比较检验值，①P<0.05；②表示1组与3组间比较检验值，②P<0.05；③表示1组与4组间比较检验值，③P<0.05；④表示2组与3组间比较检验值，④P<0.05；⑤表示3组与4组间比较检验值，⑤P<0.05；⑥表示2组与4组间比较检验值，⑥P<0.05

2.3APOE基因表达与不同年龄分期AD老年患者认知功能障碍的关系:不同APOE基因亚型患者的MMSE评分、ADAS-cog评分、ADL评分比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，两辆组间LSD-t检验，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 APOE基因表达与不同年龄分期AD老年患者认知功能障碍的关系

注：因E2/E2型亚型均未出现，故不纳入统计，等位基因与基因亚型的统计结果相同，故不再赘述.①表示E2/E3型与E2/E4型比较检验值，①P>0.05；②表示E2/E4型与E3/E3型比较检验值，②P>0.05；③表示E3/E3型与E3/E4型比较检验值，③P>0.05；④表示E3/E4型与E4/E4型比较检验值，④P>0.05；⑤表示E2/E3型与E3/E3型比较检验值，⑤P>0.05；⑥表示E2/E3型与E3/E4型型比较检验值，⑥P>0.05；⑦表示E2/E3型与E4/E4型比较检验值，⑦P>0.05；⑧表示E2/E4型与E3/E4型比较检验值，⑧P>0.05；⑨表示E2/E4型与E4/E4型比较检验值，⑨P>0.05；⑩表示E3/E3型与E4/E4型比较检验值，⑩P>0.05

3 讨 论

AD为最常见的老年中枢神经系统疾病，其起病隐匿，早期仅表现出情境记忆障碍，随着病情进展，逐渐表现出语言能力、精神行为、认知功能等障碍，最终彻底丧失自我生活能力，多数患者于患病后的10～20年左右，并发其他疾病而死亡[5]。目前，AD的发病机制尚不明确，普遍认为其与多种基因及环境因素以及两者间的相互作用有关。APOE的等位基因E4被证实与迟发型AD密切相关，是AD的独立危险因素之一。

APOE是多个氨基酸构成的糖蛋白，其参与脂质代谢过程的调控。其主要合成至神经、肝脏组织细胞，并在高密度蛋白(HDL-C)、乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、β-VLDL中表达[6]。APOE参与AD发生、进展与其在修复神经元损伤及调控髓鞘磷脂代谢有关，当神经细胞损伤时，APOE表达量随之增加，并在不同年龄分期中表达量有所不同[7]。现代基因技术证实，APOE具有3种等位基因分别为APOE2、APOE3、APOE4，且存在6种不同基因亚型：纯合子：E2/E2、E3/E3、E4/E4，杂合子：E2/E3、E2/E4、E3/E4，正常人体内E3的表达频率最高，E2、E4的表达频率较低[8,9]。

本研究中结果表明，APOE的基因亚型表达中，4组患者的E3/E3、E3/E4亚型的表达量明显高于其他亚型的表达，而在等位基因中，E3的表达频率最高，与以往研究结果一致，此外发现，E4基因随着年龄的增长，而呈现上升趋势。认知功能方面，1组患者的MMSE评分高于2、3、4组，而ADAS-cog、ADL评分均低于2、3、4组，表明随着AD发病年龄的升高，认知功能障碍情况越严重，与张婷等[10]研究结果相同。Pearson相关分析结果中，APOE基因的表达与MMSE评分呈显著负相关，而与ADAS-cog、ADL评分呈显著正相关，提示APOE表达量越高，认知功能障碍程度越深。

综上所述，不同年龄分期老年AD患者APOE基因表达不同，且其APOE4基因的表达与认知功能障碍密切相关，故临床中可通过调控APOE4基因的表达来延缓AD的发病年龄。