IL-8基因型多态性及其表达水平对鼻咽癌易感性的诊断价值

潘国刚, 杨碧秀, 王春芳, 许桂丹, 梁丽娜, 龙红兵, 邓益斌

(右江民族医学院附属医院, 广西 百色 533000)

鼻咽癌( Nasopharyngeal carcinoma, NPC)在头颈部肿瘤中最为高发，据世界卫生组织的报道，中国占全球NPC发病率的40%，在临床工作中，由于NPC发病隐匿，大部分确诊时已处于中晚期，易转移复发风险高，死亡率急剧上升[1,2]，因此提高早期NPC诊断率及预后的判断尤为重要。有关NPC的生物标志物，中国抗癌协会的肿瘤标志专业委员会专家推荐将血浆EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)DNA 检测作为NPC早期筛查、治疗方案制定及预后判断的重要指标[2]。既往研究表明除EBV外，包括血清乳酸脱氢酶、C反应蛋白、甲基化标志物、白细胞介素-8(Interleukin-8 ，IL-8)等可作为NPC特异性的生物免疫标志物，其中IL-8是一种由巨噬细胞、上皮细胞、气道平滑肌细胞、内皮细胞、肿瘤细胞等多种细胞所产生的一种趋化因子，是多种癌症发生发展的重要免疫调节因子[2]。IL-8的表达水平与NPC的发生和转移密切相关发生，作为中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞的趋化因子，在急性炎症反应的发生和迁移中起着关键作用[3,4]。而IL-8基因寡核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)在NPC患者中的研究结果尚不清楚[3,5]。本文通过NPC患者进行病例对照研究，评估IL-8 SNPs及其表达水平对NPC易感性的诊断价值，为临床更精准的治疗NPC患者提供靶向治疗位点。

1 资料与方法

1.1一般资料:收集我院住院的NPC患者168例，以及同期体检健康人群232例为对照组，纳入标准：病理检测确诊为鼻咽癌，所有患者进行放、化疗治疗，血化验诊疗资料完整；排除标准：存在其他系统疾病，如心脑肺、血液系统疾病，严重感染、风湿免疫感染疾病；收集所有研究对象的临床及病理资料，包括年龄、性别、吸烟、饮酒、EBV感染情况。

1.2IL-8基因型多态性及血清IL-8表达水平检测:抽取所有研究对象的血液样本，应用试剂盒提取DNA，利用聚合酶链反应-限制片段长度多态(PCR-RFLP)方法对IL-8基因-251、+781、+1633及+2767位点进行基因分析，引物序列为：IL-8-251位点：正向：5'-TCATCCATGATCTTGTTCTA-3'，反向： 5'-GGAAAACGCTGTAGGTCAGA-3'， IL-8+781：正向5'-CTCTAACTCTTTATATAGGA-3'， 反向5'-GATTGATTTTATCAACAGGC-3'，IL-8+1633：正向5'-CTGATGGAAGAGAGCTCTGT-3'，5'-TGTTAGAAATGCTCTATATT-3，IL-8+2767：正向5'-CCAGTTAAATTTTCATTTCA-3'，反向 5'-CAACCAGCAAGAAATTACTA-3'，PCR循环条件为：94℃预变性5min，循环1次；94℃ 变性30s，35个循环；55℃退火30s，72℃延伸30s；最后在72℃延长10min；IL-8-251、IL-8+781、IL-8+1633 和IL-8+2767位点的长度分别为524bp、203bp、397bp、222bp，分别用MfeI、EcoRI、NlaII、BstZ17I限制性内切酶消化，在2%琼脂糖上电泳跑胶，条带分别为(449bp、75bp)、(184bp、19bp)、(234bp、163bp)、(198bp、24bp)，挑取正确条带进行测序分析[3]；血清IL-8表达水平检测应用酶联免疫吸附法(ELISA)进行IL-8水平检测，具体步骤参照IL-8检测试剂盒严格进行(武汉云克隆科技股份有限公司，SEA080Hu)，收集鼻咽癌患者血液血清，加入到提前包被IL-8抗体的96孔酶标板中，用生物素标记的抗体孵育1h，HRP标记孵育30min，最后用酶标仪测96孔内的吸光度。

1.3统计学分析:应用SPSS21.0软件进行分析。计数资料以均数±标准差表示，行t检验；计量资料以(%)表示，行χ2检验；以多因素logistic回归分析比较IL-8 SNPs与NPC易感性的关系，关联强调用优势比(OR)和95%置信区间(95%CI)及交互作用指数表示，S>1为正交互，S<1为负交互，利用工作特征性曲线(ROC)评价IL-8表达水平在NPC的诊断价值。以P<0.05为统计学意义。

2 结 果

2.1两组间一般资料比较:鼻咽癌组(NPC组)168例，健康对照组(NC组)232例，两组患者在年龄、性别、饮酒等方面差别无统计学意义(P>0.05)，两组在吸烟、EBV感染差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2两组间IL-8基因型分布、等位基因频率及IL-8表达水平比较:IL-8 -251位点3种基因型(TT、TA、AA)中TT和TA基因型在NPC中显著升高，AA基因型在NPC中显著降低，差异有统计学(P<0.05)，而等位基因T和A在两组间差别无统计学意义(P>0.05)；IL-8+781位点3种基因型(CC、CT、TT)、IL-8+1633位点3种基因型(CC、CT、TTT)、IL-8+2767位点3中基因型(AA、AT、TT)及其相应的C/T、C/T、A/T等位基因，两组间差异无统计学意义(P>0.05)；IL-8在NPC的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 两组间人口学资料特征比较

表2 两组间IL-8基因型等位基因频率及表达水平比较

2.3IL-8-251位点与NPC易感性的多因素logistic回归分析:IL-8-251位点携带TT基因型(OR=1.98，95%CI：1.00～3.82)和TA基因型(OR=1.35，95%CI∶1.01～2.61)患NPC的风险显著升高，而携带AA基因型(OR=1.76，95%CI：1.02～3.08)患NPC的风险显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 IL-8-251位点基因型与NPC易感性多因素Logistic回归分析

2.4IL-8-251基因型多态性在不同因素暴露下对NPC易感性的交互作用分析:IL-8-251位点SNPs与在吸烟、EBV感染因素下对NPC易感性存在交互作用，该位点与吸烟(S=0.91)、EBV感染(S=0.82)存在负交互作用，见表4。

表4 IL-8-251基因型位点SNPs与不同因素在NPC发生中的交互作用

2.5IL-8水平对NPC的诊断价值:根据血清IL-8水平对NPC的诊断价值绘制ROC曲线，IL-8水平的的曲线下面积(AUC)为0.852，其敏感性为86%，特异性为78%，见图1。

图1 IL-8水平对NPC诊断价值的ROC曲线

3 讨 论

NPC发病机制十分复杂，目前病因尚不明确，多为EBV感染及环境因素共同作用的结果，尽管影像学检查对于NPC的诊断具有特异性，但血浆EBV DNA筛查仍是NPC诊断的金标准[6,7]。随着影像成像技术的发展，个性化的综合放化疗策略有助于提高生存率，降低毒副作用，广泛应用于人群筛查、预后预测和疾病监测，免疫治疗作为一种新型治疗方法在多种晚期恶性肿瘤的治疗中发挥着重要作用，已成为除手术、放化疗外的另一种重要的治疗手段，在NPC中具有广阔的应用前景[8～10]。

肿瘤组织中的癌细胞以及癌旁组织的免疫细胞等间质细胞，都会释放细胞因子。IL-8又称为趋化因子CXCL8，是上皮细胞和巨噬细胞等分泌的细胞因子。研究表明IL-8基因及SNPs与包括鼻咽癌在内的的多种人类恶性肿瘤的发生发展过程中发挥潜在作用，可作为免疫治疗的靶点[11]。IL-8在多种癌组织中高表达，IL-8过表达可导致疾病进展，在低氧微环境下，IL-8作为一种趋化因子，对多种细胞具有趋化及激活作用，在炎症、免疫反应中起到重要的作用，同时也是一种促血管生成因子，可促进肿瘤细胞、内皮细胞及中性粒细胞增殖、存活和逃脱程序性细胞死亡及侵袭、扩散、迁移[3]。 IL-8基因的表达可通过以下途径：①与多种转录因子相互作用来调节其表达；②参与翻译阶段细胞蛋白的合成；③参与蛋白的翻译后调节作用，可激活IL-8通路相关上下游序列。IL-8基因位于人类基因组的4q12-q13，由4个外显子组成，IL-8基因寡核苷酸多态性(SNPs)，即启动子区域-251 T/A、+781 C/T、+1633 C/T和+2767 A/T是否影响IL-8的表达，以及与NPC的易感性研究，目前研究较少，本研究拟探讨IL-8基因型多态性及其表达水平对NPC患者易感性的诊断价值，以期临床早期诊断及治疗NPC患者。

在本研究中，我们发现IL-8启动子-251 T/A 基因型与NPC易感性有关，IL-8-251位点携带TT基因型和TA基因型患NPC的风险显著升高，而携带AA基因型患NPC的风险显著降低， 在启动子区域(251A/T)发生突变，可影响IL-8 基因的转录异常，导致IL-8基因表达下降，提示IL-8可能介导感染炎症作用引起NPC疾病的发生发展，本研究的结果与以往研究存在不一致[3,7]，可能归因于不同的人群，不同的暴露因素，或相对较小的样本量，未来的研究需要进一步扩大样本来验证该位点多态性与NPC的发生的关联性在本研究亦发现NPC患者中IL-8表达升高，考虑其与NPC疾病进展有关，且对NPC的易感性具有诊断价值。据报道，慢性吸烟和EBV感染是鼻咽癌发生的病因，降低了患者的生存率[12]，与本研究报道一致，在NPC人群中患者吸烟、EBV感染明显增多，可能与NPC发病相关，但其具体机制尚不明确，本研究中在吸烟、EBV暴露因素下，IL-8-251位点SNPs与吸烟、EBV感染因素对NPC易感性存在负交互作用，可见，IL-8基因多态性(-251 T/A 基因型)和表达升高可用来预测NPC疾病复发、远处转移的风险，可作为评估NPC治疗效果的一个特异性生物学指标。

综上所述，IL-8-251基因位点TT基因型和TA基因型患NPC的风险显著升高，AA基因型患NPC的风险显著降低，且鼻咽癌患者IL-8表达水平明显升高，对NPC易感性具有诊断价值，IL-8-251位点SNPs与吸烟、EBV感染因素对NPC易感性存在负交互作用。因此，IL-8基因型多态性及表达水平可用于NPC发病风险评估和早期诊断，可作为免疫治疗一个有效靶点，在临床上具有应用推广价值。