化痰通络方含药血清对血管内皮生长因子诱导的脐静脉内皮细胞增殖的影响及其机制研究

邱明山 陈进春 林双杰 钱丽霞 张少红 李良成

【摘 要】目的：观察化痰通络方含药血清对血管内皮生长因子（VEGF）诱导的脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响及其机制。方法：将20只新西兰兔随机分为化痰通络方高（HTTL-h）、中（HTTL-m）、低（HTTL-l）剂量组，雷公藤多苷组（TG组），生理盐水组（Sal组），每组4只。分离鉴定健康新生儿HUVEC，siRNA敲降VEGFR2、PLCG1以及MAPK1，并采用RT-PCR和及Western Blot检测VEGFR2、PLCG1和MAPK1 mRNA 及蛋白水平的表达。MTT法检测经VEGF诱导的HUVEC增殖情况。结果：与Sal组比较，VEGF可显著促进HUVEC增殖，而TG或HTTL-l均可显著抑制VEGF诱导的HUVEC增殖;siRNA敲降VEGFR2后，VEGF则不能促进HUVEC增殖，同时TG也失去了对HUVEC增殖的抑制能力;siRNA敲降PLCG1后，VEGF依然可以显著促进HUVEC增殖，此时TG对VEGF刺激的HUVEC增殖失去了抑制效应，但HTTL-m和HTTL-l依然对VEGF刺激的HUVEC增殖具有显著抑制效应;siRNA敲降MAPK1后，VEGF也可显著促进HUVEC增殖，TG对VEGF刺激的HUVEC增殖具有抑制效应，同时HTTL-l也对VEGF刺激的HUVEC增殖具有显著抑制效应。结论：化痰通络方含药血清对VEGF诱导的HUVEC增殖具有抑制作用。TG抑制VEGF诱导的HUVEC增殖依赖于VEGFR2和PLCG1表达，而化痰通络方对VEGF刺激的HUVEC增殖的抑制效应则不依赖VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信号通路。

【关键词】 关节炎，类风湿;化痰通络方;血管内皮生长因子;脐静脉内皮细胞;增殖;信号传导通路

【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of serum containing Huatan Tongluo Fang（HTTL，化痰通絡方）on the proliferation of HUVEC induced by VEGF and its mechanism.Methods：Twenty New Zealand rabbits were randomly divided into the High（HTTL-h），medium（HTTL-m），low（HTTL-l） dose groups，the Tripterygium wilfordii glycoside group（TG group） and the saline containing serum group（Sal group），4 rabbits in each group.Healthy neonates HUVEC were isolated and identified，and siRNA knocked down VEGFR2，PLCG1，and MAPK1.RT-PCR as well as Western Blot were used to detect the expressions of VEGFR2，PLCG1，MAPK1 mRNA and protein levels.The proliferation of HUVEC induced by VEGF was detected by MTT.Results：Compared with the Sal group，VEGF could significantly promote HUVEC prolifer-ation，while TG or HTTL-l could significantly inhibit HUVEC proliferation induced by VEGF.After siRNA knocked down VEGFR2，VEGF could not promote HUVEC proliferation，while TG also lost the inhibition of HUVEC proliferation.After siRNA knocked down PLCG1，VEGF could still significantly promote HUVEC proliferation，and at this time TG could not stimulate HUVEC proliferation stimulated by VEGF.However，HTTL-m and HTTL-l still had a significant inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF.After siRNA knocked down MAPK1，VEGF could also significantly promote HUVEC proliferation，TG had a inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF，and HTTL-l also had a significant inhibitory effect on HUVEC proliferation stimulated by VEGF.Conclusion：The serum containing HTTL can inhibit the proliferation of HUVEC induced by VEGF.In TG group，the inhibition of HUVEC proliferation induced by VEGF depended on the expression of VEGFR2 and PLCG1，while the inhibition of HTTL on HUVEC proliferation stimulated by VEGF did not depend on the VEGF/VEGFR2/ PLCG1/ MAPK1 signal pathway.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid;Huatan Tongluo Fang（化痰通络方）;VEGF;HUVEC;proliferation;

signal transduction pathway

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以血管异常增生、关节滑膜炎为基本病理表现的自身免疫反应性疾病[1-2]。血管异常增生是RA滑膜炎和血管翳的基础[2]，促进血管形成的最主要因子是血管内皮生长因子（VEGF）。VEGF可通过作用于关节滑膜内以及基底组织的微血管或毛细血管促进其增生[3]。笔者根据历代医家对痰、瘀致痹的认识，结合临床观察、治疗实践以及前期的实验研究总结出痰浊、瘀血的病理变化贯穿于RA的发病过程，并以化痰通络方治疗RA，在动物实验及临床试验中取得了较好的疗效[4-5]。在前期動物实验中，笔者发现化痰通络方能抑制胶原诱导性关节炎大鼠关节滑膜组织VEGF和VEGFR2表达，进而抑制血管增生和血管翳的形成[6]。本研究中，笔者利用体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC），通过敲降VEGFR2/PLACG1/MAPK1观察化痰通络方抑制血管增生的潜在机制，以期能进一步了解化痰通络方发挥作用的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物与细胞 雄性新西兰兔20只，体质量（2.0±0.5）kg，动物许可证号SCXK（沪）2012-0011，由厦门大学动物实验中心提供，动物实验获得厦门大学动物伦理委员会审查。细胞株：获得健康志愿者签署知情同意书，通过健康新生儿脐带分离培养HUVEC。健康新生儿脐带，由福建中医药大学附属厦门市中医院产科提供。

1.2 药品与试剂 化痰通络方（胆南星10 g、桃仁10 g、僵蚕10 g、白芥子10 g、白芍15 g，以上中药饮片均由康美药业有限公司生产，为同一批号产品）。雷公藤多苷片（TG，福建汇天生物药业有限公司，国药准字Z35020431，规格10 mg/片）;

cDNA合成逆转试剂盒（Thermo Fisher Scientific，K1622）;TransStart Top Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，K10225）;DAB染色（福州迈新生物技术开发公司）;siRNA利用Thermofisher提供的在线设计工具进行设计，并在上海吉马生物技术公司合成。

1.3 仪 器 PCR仪（Bio-Rad，S1000）;倒置显微镜（Olympus，BX53F）;显微照相系统（Olympus，U-TV05XC-3）;电热恒温水浴箱（上海精宏，DK-8D）;超净工作台（苏净安泰）;自动酶标仪（Bio-Rad，iMark）;流式细胞仪（EPICS ALTRA）;-80℃低温冰箱（Thermo Scientific，8920）。

2 方 法

2.1 化痰通络方含药血清的制备 将20只新西兰兔随机分为化痰通络方高（HTTL-h）、中（HTTL-m）、低（HTTL-l）剂量组，TG组和生理盐水组（Sal组），每组4只。分别灌胃化痰通络方、TG、Sal，每日早、晚各灌胃1次。实际灌胃剂量按动物体表面积换算得出，每公斤体质量每日灌胃量为1，5，10倍临床等效剂量，HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l组按4.5 g·kg-1·d-1、22.5 g·kg-1·d-1、45 g·kg-1·d-1灌胃化痰通络方，TG组按7.35 g·kg-1·d-1灌胃TG，连续灌胃3 d，禁食12 h后灌胃1次（1 d的量），共灌7次，1 h后乙醚麻醉动物，无菌条件下心脏采血。将抽取的血液室温下静置3 h，离心，取上清，56 ℃水浴中灭活30 min，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装-80 ℃保存备用。

2.2 HUVEC的培养 HUVEC分离培养采用阮溦等[7]改良的方法。取健康新生儿脐带，以Ⅱ型胶原酶消化，离心分离后加入完全培养基（M199、体积分数为10%的优质胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、质量分数为6.67%的HEPES、8 ng·mL-1 VEGF）培养。对培养的HUVEC进行形态学和免疫细胞化学及流式细胞检测，选取CD106阴性、CD31阳性率 > 99%的HUVEC进行后续实验。

2.3 MTT法检测化痰通络方含药血清对VEGF诱导的HUVEC增殖

2.3.1 实验分组 将HUVEC分为以下7组：HUVEC组，HUVEC + VEGF组，HUVEC + VEGF + Sal组，HUVEC + VEGF + TG组，HUVEC + VEGF + HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l剂量组。

2.3.2 各组细胞处理 在实验中分别对不同浓度的VEGF、血清探讨，最终选择12.5 ng·mL-1的VEGF与体积分数为5%的血清进行后续实验。取上述培养的HUVEC，质量分数为0.05%的胰酶消化后接种于96孔培养板，5000细胞/孔，用含体积分数为10% FBS的M199培养液培养24 h，分别加入质量分数为5%的Sal血清，质量分数为5%的TG含药血清及HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l组质量分数为5%的化痰通络方含药血清，每组均设复孔3个，培养4 h。加入12.5 ng·mL-1 VEGF 再分别培养12，24，48 h。

2.3.3 MTT法检测HUVEC增殖 弃原培养液，每孔加入100 μL无血清培养液，30 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），37 ℃培养4 h。200 μL DMSO溶解，振荡混匀。在自动酶标仪上波长490 nm处检测吸光度值。细胞增殖率 = （实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

2.4 siRNA下调VEGFR2、PLCG1和MAPK1的表达 分别设计、优化了敲降VEGFR2、PLCG1以及MAPK1的siRNA 序列（见表1）。用罗氏X-treme GENE siRNA 转染试剂将上述siRNA序列分别转染HUVEC，72 h后，胰酶消化，收细胞-80 ℃冻存，分别进行RT-PCR和Western Blot检测敲降效率。

2.5 RT-PCR检测siRNA 敲 降效率 取上述冻存细胞，加入1 mL Trizol按照常规方法提取总RNA。依据MBI Fermentas的逆转录试剂说明书，将RNA逆转为cDNA，然后利用表2引物分别按下述条件进行PCR反应。循环参数均为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31个循环后，72 ℃延伸10 min。GAPDH为内参。见表2。

2.6 Western Blot检测siRNA敲降效率 提取各组细胞总蛋白，用考马斯亮兰蛋白定量试剂盒测定各组样本蛋白质浓度，样品蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜、加入一抗（VEGFR2、PLCG1和MAPK1）和二抗（IgG）、显影、成像。

2.7 MTT检测化痰通络方含药血清对经RNA干扰VEGFR2、PLCG1和MAPK1的HUVEC增殖 方法同2.3.3。

2.8 观察化痰通络方含药血清对VEGF诱导的HUVEC血管环形成的影响 将Matrigel基质胶放置4 ℃冰箱中过夜融化，在预冷的48孔板中加入60 μL稀释的Matrigel基质胶溶液，37 ℃放置40 min使溶液凝固。然后每孔加入无血清RPMI 1640培养液稀释的HUVEC（1.5×104/孔）凝胶表面，37 ℃，体积分数为5%的二氧化碳培养箱中继续培养12 h。分别加入体积分数为5%的Sal血清，质量分数为5%的TG含药血清及HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l剂量组质量分数为5%的含药血清，每组均设复孔3个，培养4 h。加入12.5 ng·mL-1 VEGF再分别培养48 h。倒置显微镜下观察血管环形成，每孔随机选取5个视野，拍照，计数血管环，并统计结果。

2.9 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析及t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 HUVEC鉴定及对VEGF敏感性测定 HUVEC进行CD106（间充质干细胞标志）及CD31（血管内皮细胞标志物）鉴定，结果如图1所示，笔者所分离到的细胞CD31阳性（阳性率99%以上）而无间充质干细胞污染（CD106阴性）;同时，分离的HUVEC对VEGF的应答能力在12.5 ng·mL-1，

25 ng·mL-1时均可显著促进HUVEC增殖，见表3;因此，后续实验笔者选择12.5 ng·mL-1为VEGF的剂量刺激HUVEC;为了观测含药血清对HUVEC增殖的影响，笔者也探讨了2.5%、5%及10%体积分数的正常兔血清对VEGF诱导的HUVEC增殖，在培養的12，24，48 h内均无显著影响，见表4。所以选择兔血清体积分数为5%的含药血清进行后续实验。

其后笔者检测了siRNA分别下调HUVEC中VEGFR2、PLCG1和MAPK1后，化痰通络方含药血清对HUVEC增殖的影响。结果显示，SCR组VEGF可显著促进HUVEC增殖（P < 0.05），而TG或HTTL-l含药血清均可显著抑制VEGF诱导的HUVEC增殖（P < 0.01）;siRNA敲降VEGFR2后，VEGF则不能促进HUVEC的增殖（P > 0.05），同时TG含药血清也失去了对HUVEC增殖的抑制能力。提示VEGF刺激的HUVEC增殖依赖于VEGFR2的表达，而TG发挥作用也依赖于VEGF-VEGFR2信号通路;siRNA敲降PLCG1后VEGF依然可以显著促进HUVEC增殖（P < 0.01）。提示VEGF/VEGFR2激活后存在不依赖于PLCG1而促进HUVEC增殖的信号通路;此时，TG对VEGF刺激的HUVEC增殖失去了抑制效应。但HTTL-m、HTTL-l含药血清依然对VEGF刺激的HUVEC增殖具有显著抑制效应（P < 0.05）。siRNA敲降MAPK1后VEGF也可显著促进HUVEC增殖（P < 0.05），TG对VEGF刺激的HUVEC增殖具有抑制效应（P < 0.01），同时HTTL-l含药血清也对VEGF刺激的HUVEC增殖具有显著抑制效应（P < 0.01）。提示存在不依赖于PLCG1以及MAPK1的VEGF/VEGFR2促进HUVEC增殖的信号通路;TG抑制VEGF刺激的HUVEC增殖依赖于VEGFR2以及PLCG1的表达;而化痰通络方含药血清对VEGF刺激的HUVEC的增殖不依赖于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信号通路。见图4。

3.4 化痰通络方含药血清可显著抑制VEGF诱导的HUVEC血管环形成 为了进一步阐明化痰通络方对血管形成的影响，笔者观察了HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l含药血清对VEGF诱导的HUVEC血管环形成的影响。结果显示，与Sal组比较，TG含药血清可显著抑制VEGF诱导的血管环形成;HTTL-h、HTTL-m、HTTL-l含药血清也可显著抑制VEGF诱导的血管环形成，且呈剂量依赖性。见图5、图6。

4 讨 论

4.1 血管增生在RA 发病中的作用 RA主要病理变化为关节滑膜炎症细胞浸润、血管翳形成。血管异常增生是RA慢性增生性滑膜炎和血管翳的基础[1-2]。血管的生成受血管生成刺激因子及抑制因子的双重调节，即血管生成平衡假说，当血管生成刺激因子异常增高时，这种平衡被打破，出现病理性血管增生。RA血管病理性增生中最重要的促进血管形成的因子是VEGF[3]。中和VEGF可抑制胶原诱导的小鼠关节炎的发生[8]，表明VEGF所诱导的血管增生在RA发病中具有非常重要的作用。

4.2 化痰通络方的组方原则及现代药理研究 痰、瘀作为各证型共性的病理变化贯穿于RA整个发病过程，痰浊瘀血既是机体在致病因素作用下的病理产物，又可作为致病因素作用于机体。因此，笔者提出了RA以疏畅气机、化痰活血为主要治法的化痰通络法，应贯穿于治疗的始终。基于上述观点，笔者选取胆南星、桃仁、白芥子、僵蚕、山慈菇作为化痰通络方的药物组成。南星“治痰功同半夏”，但半夏虽属辛散，专理脾胃湿痰，而南星辛散之力胜过半夏，专主经络风痰;胆南星为南星经过牛胆汁炮制，燥性已减，性味苦凉，兼清痰热，对于痰瘀郁热更为妥当。桃仁味苦，入心肝血分，活血散瘀之力强，有推陈致新之功[9]。两者同用，有化痰祛风、消肿散结、活血化瘀、通络止痛之功，共为君药。白芥子温通经脉、消肿散结加强胆南星化痰通络之力，而为臣药。僵蚕化痰散结、涤化痰浊、祛风止痛，助胆南星化痰祛风通络之力，白芍养血柔肝、缓急止痛，两药均为佐使药。全方共奏化痰活血、通络蠲痹之功。

本项研究中，笔者应用MTT、Western Blot、RT-PCR、质粒转染等技术，以TG为阳性药，观察了化痰通络方含药血清对VEGF诱导的HUVEC增殖的影响。结果显示，TG和化痰通络方均能够抑制VEGF诱导的HUVEC增殖和血管环形成，同时应用siRNA分别下调HUVEC中VEGFR2、PLCG1后，TG不能阻断VEGF诱导的HUVEC的增殖和血管环形成;而siRNA下调HUVEC中VEGFR2、PLCG1和MAPK1后，化痰通络方含药血清可完全阻断VEGF诱导的HUVEC的增殖。提示TG抑制VEGF刺激的HUVEC增殖依赖于VEGFR2以及PLCG1的表达，而化痰通络方抑制VEGF刺激的HUVEC的增殖不依赖于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信号通路。

综上所述，笔者认为，化痰通络方能够抑制VEGF诱导的HUVEC增殖和血管环形成，但其作用机制不依赖于VEGF/VEGFR2/PLCG1/MAPK1信号通路。

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收稿日期：2019-08-27;修回日期：2019-10-25