梨果实细胞分裂期内参基因表达稳定性分析

蒲小秋，田 嘉，李 疆，张 艳，李 鹏，覃伟铭，井春芝

（1.新疆农业大学 林学与园艺学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州沙依东园艺场，新疆 库尔勒 841000；3.新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州林业科学技术推广中心，新疆 库尔勒 841000）

实时荧光定量PCR技术（quantitative real-time PCR technology，qRT-PCR technology）是开展基因表达分析的关键技术，以循环放大材料中本底基因表达量与荧光检测相结合的方法定量分析基因表达量，具有高效、灵敏、稳定和成本低等特点[1]。qRT-PCR技术分为绝对定量和相对定量分析两种，相对定量分析比绝对定量分析的应用更加简单和普遍，其通过检测样品中目标序列和另一参照序列的表达量，通过对比两种表达量对目标基因进行定量分析。相对定量分析结果的准确性常受RNA样品质量、逆转录效率、PCR效率差异、上样量及上样过程等因素的干扰，因此，需选择较为稳定的管家基因作为内参基因进行误差校正及标准化处理，理想的内参基因在植物的不同组织中和不同发育时期及不同处理中都应能稳定表达，不存在假基因且其表达量与目的基因表达量相近[2-3]。目前，植物中常用的内参基因有甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因（GAPDH）、肌动蛋白基因（Actin）、微管蛋白基因（TUB）、转录延伸因子基因（EF1α）和泛素连接酶基因（UBQ）等[4]。近年来的研究结果表明，任何一个内参基因都不能适用于所有条件下的实验研究。如GAPDH在核桃不同基因型、不同组织中、不同发育时期的表达均稳定，但在苹果不同基因型中表达的稳定性差[5-6]；UBQ在盐胁迫下玉兰不同组织器官中的表达稳定，但在黄梁木不同组织中表达的稳定性差[7-8]。因此，在利用qRT-PCR进行定量分析之前，有必要验证、筛选出稳定的内参基因，以减小供试样本间的差异性，以期获得更加准确、可靠的实验结果。

梨属于蔷薇科Rosaceae梨亚科Poaceae梨属Pyrus L.植物，在我国的分布广泛，其种质资源丰富。梨果实可鲜食、制干、榨汁、酿酒、入药等，具有重要的经济价值和社会价值。梨果实的生长时期可分为细胞分裂期和细胞膨大期两个主要时期，其在生长开始，以细胞分裂为主，在授粉50 d左右时以细胞膨大为主，梨为假果，果肉部分由花托发育形成，花期花托细胞分裂和幼果期果肉细胞分裂共同组成了梨果实细胞分裂期[9-10]。果实的细胞分裂期是对果实品质具有重要影响的时期。前人研究发现，某些基因在果实细胞分裂期大量表达，因此，果实细胞分裂期是果实品质调控的关键时期。如TIAN等人[11]发现，在梨幼果期，FWL1基因表达与果实大小呈反比关系，说明这一基因与梨果实大小发育密切相关；岳海林[12]研究发现，黄花梨中钙调素（CuCaM）在盛花期子房幼果中的大量表达，可能与果实中钙的增加有一定的关系。因此，筛选出梨果实细胞分裂期内合适的内参基因，不仅可以保证实验的准确性，还能省时省力。目前，未见到有关梨果实细胞分裂期内参基因的筛选报道，已报道的梨中常用的内参基因分别有Actin1[13]、Actin2[14]、TUB1[15]和TUB2[16]等。本研究在对梨果实细胞分裂期的内参基因进行荧光定量PCR筛选 时，选用了TUB2、TUB1、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH这8个候选基因，这些基因均为传统的内参基因，是生物体生命活动中不可或缺的。EF1α主要参与快速增殖细胞的生长与增殖[17]，UBI参与细胞中的代谢过程[4]，Actin对细胞分裂、细胞基本骨架结构的维持及细胞运动都可起到重要作用[18]，TUB控制表达生物体维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组分蛋白基因[19]，GAPDH与细胞骨架结构的形成有关[20]。目前，研究内参基因的常用手段分别有转录组分 析[21]、同源基因克隆[22]及常见内参基因稳定性分析[23]等。梨FWL1是fw2.2的同源基因，其在细胞分裂期的作用，主要负责调控果实的大小，其功能已在番茄、玉米、樱桃、梨等物种中被预测和鉴定[24]。本研究选用上述的8个常见内参基因为候选内参基因，分别以杜梨（小果型，常用来做砧木）[25]、香梨（中果型）和鸭梨（大果型）果实细胞分裂期的幼果果肉为试材，利用geNorm[26]和NormFinder[27]统计软件比较分析了各候选内参基因在梨果实细胞分裂期的表达稳定性，旨在筛选出梨果实细胞分裂期合适的内参基因。

1 材料与方法

1.1 材 料

选取来源于新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州沙依东园艺场中树龄为25 a、树势中庸、树体健康、栽培管理条件一致的杜梨、香梨和鸭梨作为供试材料，分别采集梨花露红期（对枝条进行套袋处理）、盛花期（对前期套袋处理的枝条进行统一授粉并挂牌标记，授粉品种为砀山酥梨）的花朵，去除子房以上的所有部位（包含柱头、雄蕊、花瓣），去除花柄；分别采集授粉后10、20、30、40 d的幼果果肉进行研究。每个时期采集30个混合样本，重复3次，采后立即以液氮速冻，置于-80 ℃的超低温冰箱中冻存以备用。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成

采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEND，北京）进行总RNA的提取，利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳和蛋白核酸分析仪检测总RNA的完整性、浓度和纯度；以A260/A280之值为1.8～2.1且凝胶电泳条带清晰的RNA为模板，按照FastKing RT Kit（With gDNase）反转录试剂盒（TIANGEND，北京）中说明书的操作方法反转录合成cDNA。将合成的cDNA置于-20 ℃的温度条件下保存以备用。

1.2.2 内参基因的选择

根据有关文献[23,28-29]中报道过的候选内参基因，选择了TUB1、TUB2、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH这8个候选基因作为梨不同发育时期的内参基因。所用引物来源于已报道的文献中，FWL1来源于TIAN等人[11]的研究结果，所有引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，引物的基本情况见表1。

表1 用于RT-PCR及荧光定量PCR的引物Table 1 Primers for RT-PCR and qPCR

1.2.3 内参基因的普通PCR扩增

以反转录合成的cDNA为模板，对8个候选内参基因进行普通PCR扩增，以验证引物的特异性。反应体系为25 µL，包括10×EasyTaq®Butter 2.5 µL，2.5 mM的dNTPS 2 µL，cDNA 1 µL，10 µmol/L的 上、下游引物各0.5 µL，EasyTaq®DNA Polymerase 0.3 µL，ddH2O 18.2 µL。反应程序设置：94 ℃，3 min预变性；94 ℃，10 sec变性；57 ℃，20 sec退火；72 ℃，20 sec延伸，共35个循环；最后，72 ℃，5 min延伸；用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.2.4 内参基因的qPCR扩增

使用BIO-RAD CFX Connect™ 荧光定量PCR检测系统检测各内参基因的表达情况，使用试剂为Power SYBR®Green PCR Master Mix（Applied Biosystems®Cat：4367659）。使用的PCR程序为：95 ℃，3 min预变性；95 ℃，10 sec变性；55 ℃，20 sec退火；72 ℃，20 sec延伸，共40个循环；之后于65～95 ℃的温度条件下进行溶解曲线分析，每个样品均重复3次，根据生成的溶解曲线判断8个候选内参基因的扩增特异性；并根据获得的8个基因的循环阈值（Ct值）分析各个候选内参基因在梨果实细胞分裂期的表达情况。

1.2.5 引物扩增效率的计算

根据反转录后获得的cDNA产物浓度，将不同样品分别稀释至500 ng/mL，每个样品取100 μL 并分别稀释成5个浓度梯度，每个浓度梯度稀释5倍，最终获得的标准曲线模板浓度即分别为500.0、100.0、20.0、4.0、0.8 ng/mL，每个反应设3个重复。用BIO-RAD CFX Connect™ System进行qRT-PCR反应，获得Ct值；再利用Excel制作标准曲线，即可获得相关系数(R2)和扩增效率(E)。

1.2.6 数据分析

采用Excel整理RT-qPCR检测得到的Ct值，先利用geNorm和NormFinder软件对8个内参基因的表达稳定性进行统计学分析；以FWL1为目的基因对稳定性不同的4个候选基因（TUB2、Actin1、Actin2和TUB1）进行稳定性验证，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

2 结果分析

2.1 RNA的提取

以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA，结果如图1所示。图1显示，28S、18S条带清晰，以蛋白核酸分析仪检测到的A260/A280之值为1.8～2.1，说明提取的RNA中没有蛋白质等物的污染，其完整性良好，符合后续实验的要求。

图1 梨总RNA的电泳检测结果Fig.1 Electrophoretic detection result of total RNA extracted from pear

2.2 候选内参基因引物质量的检测

对选取的8个候选内参基因进行普通PCR扩增，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，所用Mark为2 000 bp DNA，扩增产物如图2所示，其大小与理论大小一致，无特异性扩增产物，其条带整齐，无引物二聚体。对引物进行标准曲线分析，结果显示，所有引物均有良好的扩增曲线和溶解曲线，熔解曲线的熔解峰值单一（图3），通过标准曲线的绘制，可得出qPCR引物的扩增效率为99.89%～111.29%，其相关系数R2值均≥0.99，说明标准曲线线性关系良好（表2）。上述结果表明，8个候选内参基因的引物均符合qRT-PCR引物要求，均可用于梨果实细胞分裂期内参基因的稳定性评价。

2.3 内参基因的Ct值分析

在RT-qPCR分析中，内参基因的Ct值反映了基因的表达量，Ct值越小，说明基因表达量越高，而Ct值越大，基因表达量则越低。不同梨组织中8个候选内参基因的平均Ct值如图4所示。从图4中Ct值的分布情况可以看出，TUB1的平均Ct值最小，为18.14，说明其在不同组织样品中的转录水平最高；UBI的平均Ct值仅次于TUB1，为19.61；而TUB3的转录水平最低，其平均Ct值最大，为25.99；其他各候选内参基因的平均Ct值均为20～26。这一结果表明，在qRT-PCR分析中，8个候选内参基因存在差异，因此，对8个候选内参基因进行比较分析是十分必要的。

图2 8个候选内参基因引物的PCR扩增产物Fig.2 PCR products of eight candidate reference genes

图3 各内参基因的溶解曲线Fig.3 Melting curves of internal reference genes

表2 8种引物的相关系数与扩增效率Table 2 Correlation coefficients and amplification efficiencies of eight primers

2.4 内参基因的表达稳定性分析

2.4.1 以geNorm软件分析

geNorm软件分析是通过将Ct值的平均值进行对数转换后导入软件中，以基因配对的形式不断去除最不稳定的基因，最后比较基因表达稳定值（M）的大小来进行候选内参基因稳定性的排序的，其中M值越小，基因的表达稳定性则越强。以geNorm软件分析得出的8个内参基因的表达稳定值（M）见表3。从表3中可以看出，在总样本和花期样本中，各个候选内参基因的表达稳定性从高到低依次为TUB2/Actin1、Actin2、GAPDH、EF1a、UBI、TUB3、TUB1，说明在总样本和花期样本中TUB2和Actin1是最合适的内参基因；在果期样本中，各个候选内参基因的表达稳定性从高到低依次为TUB2/UBI、Actin2、GAPDH、EF1a、Actin1、TUB3、TUB1，说明在果期样本中TUB2和UBI是最合适的内参基因。对内参基因的配对差异值的分析结果如图5所示。由图5可知，在所有样本中，因Vn/(n+1)（表示配对差异值，式中的n表示内参基因数量）均大于阈值0.15，所以无法确定最合适的内参基因的个数。

图4 不同梨组织中8个候选内参基因的平均Ct值Fig.4 Mean Ct values of eight candidate internal reference genes of different pear tissues

图5 以geNorm软件分析得出的内参基因的配对差异值Fig.5 Obtained pairwise difference values of internal reference genes by using geNorm software

2.4.2 以NormFinder软件分析

NormFinder软件的计算原理与geNorm软件的相似，M值与基因稳定性呈负相关，计算所得的稳定值M越小，说明该基因表达的稳定性就越高，并以M值1.5作为该值的阈值，小于1.5的基因都处于稳定状态中。以Norm Finder软件分析所得结果见表4。由表4可知，在总样本中，TUB2基因的表达稳定值最小，为0.336，说明其表达稳定性最高；在花期样本中，Actin1基因的表达稳定值最小，为0.237，说明其表达稳定性最高；果期样本中，TUB2基因的表达稳定值最小，为0.262，说明其表达的稳定性最高。由以上分析结果可知，TUB2在总样本和果期样本中的表达均最稳定，均为总样本和果期样本中最合适的内参基因；Actin1在花期样本中的表达最稳定，是花期样本最合适的内参基因。

2.5 FWL1基因的表达分析

为了验证所筛选的内参基因在梨果实细胞分裂期中应用的有效性，选择评价稳定性高的TUB2、Actin1、Actin2和稳定性最低的TUB1为内参基因，对FWL1基因在梨果实细胞分裂期的转录水平进行分析，结果如图6所示。以TUB2为内参基因时，目标FWL1基因在盛花期和授粉后40 d 时均表现出相同的显著性差异水平，不同梨品种的FWL1基因在露红期和授粉后40 d时的花托中相对表达量的大小顺序分别为：在露红期，鸭梨＞杜梨＞香梨；在授粉后40 d时，杜梨＞香梨＞鸭梨。以Actin1或Actin2为内参基因时，FWL1的表达模式与TUB2的校正结果大部分一致。然而，以稳定性最差的TUB1为内参基因时，FWL1在不同梨品种同一花期的表达模式与TUB2的校正结果完全不一致。这一分析结果说明，稳定性不同的内参基因可能影响荧光定量PCR分析结果的准确性，甚至会导致分析结论的错误。

3 结论和讨论

本研究利用qRT-PCR技术分析了TUB2、TUB1、TUB3、Actin1、Actin2、UBI、EF1α和GAPDH基因在不同梨品种果实细胞分裂期的表达情况，利用geNorm和NormFinder内参分析软件对其进行了综合评估，筛选出了在不同样本中表达最为稳定的内参基因。在本实验体系中，TUB2为果期样本和总样本的最适内参基因，Actin1为花期样本的最适内参基因，TUB1在本实验体系中的稳定性最差，不适合用作梨果实细胞分裂期qRT-PCR分析的内参基因。利用筛选出的内参基因TUB2，分析FWL1基因的表达水平，结果表明：授粉后40 d时果肉中的FWL1基因在小果型梨（杜梨）中的表达水平要高于其在大果型梨（鸭梨）中的表达水平，此结果和FWL1基因与梨果实大小呈反比[11]这一结果相符合，这进一步证实了TUB2作为理想的内参基因可用于梨细胞分裂期的相关基因表达分析。此外，研究中发现，FWL1基因在露红期花托中的表达水平与果实大小无关，由此推测，FWL1基因与授粉前子房期的细胞分裂无直接关系。

表3 以geNorm软件分析得出的8个内参基因的表达稳定值Table 3 Obtained expression stability values of eight internal reference genes by using geNorm software

表4 以NormFinder软件分析所得8个候选内参基因的表达稳定值Table 4 Obtained expression stability values of eight internal reference genes by using NormFinder software

图6 利用不同内参基因计算得出的FWL1基因在不同梨品种同一时期中的相对表达量Fig.6 Relative expression levels of FWL1 in different pear cultivars during the same stage using different internal reference genes

实时荧光定量PCR技术已经成为分子生物学研究的基本手段[30]，通常选择表达量恒定的基因作为参照物来对定量PCR分析得出的数据进行归一化处理，进而减小样本间的检测差异[31]。内参基因的选择不具有通用性，不经过筛选直接选择某个常见的内参基因很可能使定量分析结果的精确度降低，甚至得到错误的结论[2]。前人在梨内参基因上已有一定的研究。陈杨杨等人[32]在对砀山酥梨内参基因的筛选中发现，在高温和盐胁迫条件下UBQ在叶片中的表达最稳定，WDP在不同组织器官中的表达均最稳定；张雪等人[33]在对红梨果皮组织内参基因的筛选中发现，EF-1α和His均可作为红梨果皮组织qRT-PCR分析的内参基因；Tsuyoshi等人[23]对日本梨的花芽、花器官、果肉、果皮4个组织中的内参基因进行了筛选，结果发现，不同组织需要选取不同的内参基因，这进一步说明，在分析一个新实验体系中的基因表达情况时，对内参基因的筛选是十分重要的。虽然以上研究对象都是梨，但筛选结果并非某一个通用内参基因。由此可见，在不同的实验材料和条件下获得的梨最稳定的内参基因存在差异。geNorm和NormFinder软件均为目前进行内参基因稳定性评价和验证的最常使用的软件，以不同软件分析得出的这些基因在梨果实细胞分裂期中表达稳定性的排序情况不完全一致，这可能是由不同软件使用了不同的统计模型所致的[34-35]。以geNorm软件分析发现，在梨果实细胞分裂期中，Vn/(n+1) 均大于0.15（图5），杨丹等人[36]也发现了同样的问题，这可能因为实验材料来自不同基因型，跨度较大，从而导致了变异系数均大于0.15。

笔者分别以梨果实细胞分裂不同时期的杜梨、香梨和鸭梨为材料，对梨中常用的8个内参基因的表达稳定性进行了研究，分析了在该实验体系中所选内参基因表达稳定性的差异性。内参基因的种类有很多[37]，本实验仅筛选了8个内参基因，因此，后续研究应向着扩大内参基因的筛选范围以及开发新内参基因的方向进行，进一步寻找适合该实验体系的内参基因，从而为qRT-PCR技术在梨果实细胞分裂期研究中的应用提供重要的基础资料。