生长环境及收获期对野鸦椿属植物三萜类化合物含量的影响

邹小兴，倪 林，黄 维，邹双全

（福建农林大学 a.林学院；b.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心；c.植物保护学院；d.生命科学学院，福建 福州 350002）

圆齿野鸦椿Euscaphis konishiiHayat为省沽油科Staphyleaceae野鸦椿属Euscaphis常绿灌木或小乔木[1]，是具有重要价值的观赏药用植物，在抗炎、抗癌、保肝等方面作用显著[2-6]，也是畲药“鸡眼睛”[7]和苗药“血脉通胶囊”[8]的重要原料。近年来，多种具有显著药理活性的三萜类化合物已经从同属野鸦椿E.japonica植物体中分离得到[9-11]。但是，关于圆齿野鸦椿体内三萜类化合物含量及其与野鸦椿三萜类化合物含量的差异、三萜类物质在圆齿野鸦椿不同部位的分布情况、不同生长区域和采收月份对圆齿野鸦椿体内总三萜类化合物积累的影响等方面的研究仍未见报道。为此，笔者针对以上问题展开研究，以探寻三萜类化合物在野鸦椿和圆齿野鸦椿植物体内积累的规律，为进一步研究其药用价值和科学栽培奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地分别位于福建省邵武市将石自然保护区（以下简称为“邵武”，SW）、清流县益晟园林苗木基地（以下简称为“清流”，QL）、福建农林大学科技园（以下简称为“农大”，ND）和福州市闽清县下祝乡翁山头（以下简称为“闽清”，MQ）。圆齿野鸦椿种植密度为2 m×2 m。以GPS测定各试验地的经纬度、海拔，从当地气象部门采集各试验地的气候因子数据。采集各试验地的土壤样品，测定其碱解氮、速效磷和速效钾含量。各试验地概况见表1。

表1 各试验地概况Tabble 1 Each test plot status

1.2 试验材料

1.2.1 试验植株的选择

2014年6月，分别在邵武、清流、农大3个试验地选择长势良好的8年生圆齿野鸦椿各10株，在闽清试验地选择6年生野鸦椿和圆齿野鸦椿各10株，挂牌标记，进行常规水肥管理。

1.2.2 样品采集

闽清试验地野鸦椿和圆齿野鸦椿叶片和枝条的采样时间为2014年8月；清流、邵武、农大3个 试验地的采样时间均分别为2014年11月（圆齿野鸦椿果实成熟即其旺盛生长基本结束时期）和2015年3月（春季植株开始抽芽前时期），2014年 11月采集叶片、枝条、果实和种子，2015年3月只采集叶片和枝条。采集时，从挂牌标记植株的不同方位采集叶片（2014年春季萌发的叶片）、枝条（顶芽往下约35 cm处）和果实。各样品采集量均为500 g，分别放入信封中，带回实验室以备用。

1.3 总三萜含量的测定

将果皮和种子分离，然后将所有样品经40 ℃烘干，粉碎，过40目筛，低温密封保存。利用高氯酸和5%的香草醛-冰醋酸溶液与三萜类化合物的显色反应，采用比色法[12]测定三萜类化合物的含量。

1.3.1 标准曲线的绘制

分别精确吸取以无水乙醇为溶剂溶解的齐墩果酸标准溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL，分别置于5 mL的容量瓶中，在80 ℃的水浴上蒸干后加入0.30 mL的新制5%的香草醛-冰醋酸溶液（称取香草醛1.25 g，迅速用适量冰醋酸溶解转入25 mL的容量瓶中定容，当日使用）和1.00 mL的高氯酸后摇匀，于60 ℃的水浴保温反应 20 min后，用流水将其冷却至室温，再加入冰醋酸定量到10 mL，摇匀，同时作试剂空白，以空白对照和不同浓度水平的齐墩果酸对照品溶液分别在400～900 nm的波长范围内扫描，确定对照品的最大吸收波长。在波长为550 nm 处以试剂空白为参比，用1 cm的比色皿测定体系吸光度值（OD值）。以齐墩果酸的微克数为纵坐标，以OD值为横坐标，建立标准曲线（n=3），其标准曲线如图1所示，其回归方程为：

y=0.021 1x+0.000 7，R²=0.998 4。

式中：y表示对照品中齐墩果酸的浓度（mg·mL-1）；x表示溶液在波长为510 nm处的吸光值。从图1中可以看出，标准曲线回归方程的线性关系良好（R2=0.998 4），可用作待测液中总三萜类化合物含量的计算公式。

图1 齐墩果酸对照品标准曲线Fig.1 A standard curve of oleanolic acid as reference substance

1.3.2 样品测定

取干燥样品粉末约0.1 g，精密称定，置于具塞试管中，加入10 mL的无水乙醇提取48 h后，离心除去沉淀，吸取上清液0.2 mL于试管中，80 ℃水浴挥干。然后依照1.3.1中说明的方法测定各样品的吸光值。

1.4 数据分析

分别采用Excel 2007和SPSS 17.0等统计分析软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 野鸦椿和圆齿野鸦椿三萜含量差异

野鸦椿和圆齿野鸦椿不同采样部位的总三萜类化合物含量如图2所示。由图2可知，2014年8月从闽清县下祝乡1 022 m 高海拔样地采集的野鸦椿叶片中三萜类化合物的含量为4.48%，比圆齿野鸦椿的高0.6%，其差异达极显著水平（P＜0.01）；两者枝条中三萜类化合物的含量，圆齿野鸦椿略高于野鸦椿，其差异并未达到显著水平（P＞0.05）。

图2 野鸦椿和圆齿野鸦椿不同采样部位的总三萜类 化合物含量Fig.2 Total riterpenoids contents in different sampling parts of E.japonica and E.konishii

2.2 不同部位总三萜类化合物的分布情况

采集于不同试验地的圆齿野鸦椿其不同部位的总三萜类化合物含量如图3所示。由图3可知，2014年11月分别从农大、清流和邵武采集的圆齿野鸦椿叶片中总三萜类化合物的含量分别达到9.06%、7.14%与6.85%，均显著高于其他采样部位（P＜0.05）。采集于不同月份不同试验地的圆齿野鸦椿其不同部位的总三萜类化合物含量如图4所示。由图4可知，其不同部位的总三萜类化合物含量，也是叶片＞枝条，说明叶片累积了更多的三萜类物质。圆齿野鸦椿各部位的总三萜类化合物含量由高到低依次为：叶片＞枝条＞果皮＞种子。

图3 采集于不同试验地的圆齿野鸦椿其不同部位的总三萜类化合物含量Fig.3 Contents of total triterpenoids in different parts of E.konishii collected from different test plots

2.3 不同生长区域对圆齿野鸦椿总三萜类化合物含量的影响

从图3中还可看出，2014年11月采集的圆齿野鸦椿各个部位中总三萜类化合物含量的多少基本依次为：农大＞清流＞邵武。采集于农大的圆齿野鸦椿，其叶片的总三萜含量比其枝条的高164.91%；而采集于清流的叶片总三萜含量比其枝条的高106.36%；此两个数值之间存在明显的差别，说明在不同的栽培环境下三萜类物质会在圆齿野鸦椿的某一部位富集。

当进入11月，即圆齿野鸦椿进入果实成熟期而其旺盛生长基本结束时，其叶片中总三萜的含量均大于6.85%，而其枝条中三萜的含量均在2.89%以上，但此时野鸦椿已落叶。

2.4 冬季低温对圆齿野鸦椿总三萜类化合物含量的影响

从图4中还可看出，2014年11月和2015年3月采集的圆齿野鸦椿样品中总三萜类化合物的含量存在显著（P＜0.05）或极显著水平的差异（P＜0.01）。除采集于农大的枝条外，不同月份采集于其他3个地区的枝条和叶片的总三萜类化合物含量，均是3月大于11月。三萜类物质含量最多的可以提高172.91%，说明冬季低温更有利于圆齿野鸦椿中三萜类物质的产生和积累。

2.5 各试验地的地理和气候因素对圆齿野鸦椿总三萜类化合物含量的影响

各试验地的地理和气候因素与圆齿野鸦椿各部位的总三萜类化合物含量间的相关系数见表2。表2表明，圆齿野鸦椿叶片中总三萜类化合物的含量与各试验地的海拔、年均气温、年降水量及年均无霜期之间均存在极显著的相关性（P＜0.01），其果皮中总三萜类化合物的含量与各试验地的海拔、年均气温、年降水量之间均存在极显著的相关性，其种子中总三萜类化合物的含量与试验地的海拔、年均气温、年降水量之间均存在极显著的相关性，而其枝条中总三萜类化合物的含量与试验地的海拔、年均气温、年降水量之间的相关性均不显著，除枝条外，各部位总三萜类化合物含量与海拔和年降水量这2个因素之间均表现出极显著的负相关关系，而其与年均气温之间却表现出极显著的正相关关系。

表2 不同栽培区域的地理和气候因素与各部位中总三萜类化合物含量间的相关系数†Table 2 Correlation coefficients of geography and climate factors at different cultivation regions with content of total triterpenoids in each part

3 结论与讨论

3.1 结 论

中药材产地和采收时间均为影响药材质量的重要因素。吴雪松等人[13]的研究结果表明，不同产地的生晒参和红参药材中总皂苷和单体皂苷量的差异较大，长白、集安康美、抚松、靖宇4个产地的生晒参和红参皂苷量的综合评价值均较高，而有的产地没有却达到《中国药典》中的规定；钱龙梁等人[14]发现，不同试验地其气候等条件的差异对嫁接银杏叶片中黄酮类化合物含量存在影响；刘和平等人[15]研究发现，不同生长期水栀子果实中西红花苷I、西红花苷Ⅱ和栀子苷的含量存在显著差异，每年的11—12月是最佳采果期；张杲等人[16]认为，5—6月是采收连翘叶的最佳时期，因为5月连翘苷含量最高，6月连翘酯苷和芦丁含量均最高；李晓英等人[17]的研究结果表明，8—9月蓝莓叶中总黄酮的含量显著高于其在5—6月的含量，且9月的总黄酮含量最高，说明此期的抗氧化能力高于其他3个生长时期的；马力等人[18]认为，油茶籽适宜采摘期为霜降节前后。采收于不同产地的圆齿野鸦椿其不同部位的总三萜含量存在较大差异，如采集于邵武的枝条其总三萜含量达到7.89%，而农大的只有2.03%；不同季节采收的圆齿野鸦椿其总三萜含量也存在差异，2015年3月采集于3个样地的圆齿野鸦椿其枝条（农大枝条的除外）和叶片的总三萜类化合物含量均大于11月采集的，经过一个冬季的积累，其三萜含量最多可以提高172.91%。相关分析结果表明，除枝条外，圆齿野鸦椿叶片、果皮和种子中总三萜类化合物的含量与采样地的海拔和降水量均呈显著的负相关关系，而与年平均温度均呈正相关关系。

3.2 讨 论

1）本研究存在的局限性。许多研究者[19-22]发现，随着海拔高度的升高植物次生代谢产物也随之增加，但是，本研究结果表明，总三萜类化合物的含量与海拔呈显著的负相关关系，这是否是因为样品采自3个不同地区，除海拔影响外，还受不同地区的温度、光照、湿度等因素的影响，对此有待于进一步研究。

野鸦椿和圆齿野鸦椿均作野鸦椿药材用，但两者在形态和生长习性上均存在一定的差异[4]：野鸦椿冬季会落叶，而圆齿野鸦椿属常绿树种；野鸦椿8月已处于果实成熟期，其生长由旺盛期向落叶期转变；而圆齿野鸦椿11月才进入果实成熟期，其旺盛生长期才开始结束。虽然野鸦椿叶片中总三萜类化合物的含量显著高于圆齿野鸦椿叶片中的含量，但其于11月已落叶；而11月不同栽培基地上的圆齿野鸦椿其三萜类化合物的含量均大于6.85%，且此时其枝条中三萜类化合物的含量也高于野鸦椿的；就挂果率而言，圆齿野鸦椿远高于野鸦椿，但其抗寒性却不如野鸦椿，这就限制了圆齿野鸦椿向高海拔、高纬度地区的推广种植。至于野鸦椿和圆齿野椿这些差异是如何形成的，如何增强圆齿野鸦椿的抗寒性，这些问题都值得进一步研究。

2）下一步研究的方向。针对上述问题，一是进行同一地区不同海拔梯度及相同海拔梯度不同地区的区域化栽培试验，深入探讨影响圆齿野鸦椿三萜含量的气候、环境因子，为圆齿野鸦椿适生环境的选择提供科学依据；二是开展野鸦椿和圆齿野鸦椿杂交试验，选育出分布较广、抗性较强、成熟期早、三萜含量高的抗寒新品种。