胡萝卜冰结构蛋白的诱导及对淀粉凝胶冻融稳定性的影响

李亚楠,曲 敏,田 野,陈凤莲,吴 征,陈 强,孙 玥

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省普通高校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)

冰结构蛋白(Ice structuring proteins,ISPs),又称为抗冻蛋白,是生物体为抵御外界寒冷环境而产生的蛋白质[1],具有热滞活性、修饰冰晶形态和抑制冰晶重结晶的特性[2],能提高农作物的抗虫、抗冻能力[3]。ISPs能够以非依数性形式降低溶液的冰点,而对熔点影响甚微,导致水溶液熔点和冰点间出现差值(即热滞活性),因而又称为热滞蛋白[4]。ISPs的来源主要是冷水鱼类、昆虫、植物和微生物。2006年我国卫生部公布ISPs可以作为新型食品添加剂添加到冷冻食品中。由于鱼类ISPs价格昂贵,不适于大规模的食品工业加工中应用,因此,探索来源广泛、价格低廉、食物源的植物ISPs成为研究热点[5]。

张党权等[6]将胡萝卜ISPs基因在大肠杆菌中进行表达,进行初步的洗涤、纯化,得到了高度纯化的目的ISPs;Kontogiorgos等[7]提取冬小麦ISPs,添加到湿面筋体系中,研究表明冻藏过程中冬小麦ISPs可抑制冰晶重结晶,保护面筋网络结构;李玲玲[8]将女贞叶中的ISPs加入湿面筋中,显示ISPs能够提高其在冻藏过程中的持水率、降低熔化焓;焦宇知等[9]以小麦苗为对象经低温胁迫提取ISPs,小麦苗提取物中蛋白含量与未低温胁迫小麦苗提取物相比提高了7.8%;操庆庆等[10]检测了冷诱导的胡萝卜蛋白质粗提物对嗜酸乳杆菌具有冻干保护作用。研究表明冷诱导能够促进更多ISPs的产生[11]。

淀粉凝胶类食品是食品加工工业中的常见产品,然而淀粉凝胶在长时间的冷藏过程中会伴随冰晶的形成和增长,使淀粉凝胶发生相分离及面制品比容减小[12-13]的现象,体现在食品质构中甚至导致终产品质量的恶化[14]。本研究对新鲜胡萝卜进行冷诱导处理,以冰结合磷酸缓冲溶液法提取胡萝卜冰结构蛋白(Carrot ice structuring proteins,CISPs),利用SDS-PAGE检测其分子量,并将CISPs应用于冷冻淀粉凝胶中,考察对淀粉凝胶质地的抗冻保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胡萝卜 市售;小麦淀粉 黑龙江北大荒有限公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、考马斯亮蓝G250、Tris-base、SDS、丙烯酰胺、过硫酸铵、N,N′-甲叉双丙烯酰胺、四甲基二乙胺、甘氨酸、二硫代苏糖醇、溴酚蓝、甘油、甲醇等 均为分析纯。

FC204电子天平 沈阳龙腾电子有限公司;DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;XL-08多功能粉碎机 永康市帅通工具有限公司;721E可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;EMS-9A磁力搅拌器 天津欧诺仪器仪表有限公司;TDL-80-2B台式离心机 上海安亭科学仪器;LGJ-12冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;SDS-PAGE电泳仪 德国哈默公司产品;TA-XT2i质构仪 英国SMS公司;BCD-196F电冰箱 海尔集团冰箱有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CISPs的制备 采用本课题组改良的冰结合磷酸缓冲溶液法[15]提取CISPs。将胡萝卜进行清洗,经切块、粉碎、过滤、八层纱布挤出滤液,以料液比1∶15 (g/mL)与磷酸缓冲溶液(0.63 mol/L、pH8.0)混合。通过磁力器搅拌2 h后以8000 r/min离心20 min,取上清液加入考马斯亮蓝试剂,测定吸光值并记录。将剩余液体加入直径为10 mm的冰球以吸附蛋白,每100 mL液体中添加50个冰球,置于-18 ℃冰箱中冷冻2 min后取出,并倒出液体,待冰球融化后测吸光值(冰球溶化的溶液即为CISPs溶液)。将得到的CISPs于60 ℃进行浓缩,经冷冻干燥机冷冻12 h制成CISPs冻干粉备用。

1.2.2 CISPs的冷诱导

1.2.2.1 冷诱导温度对CISPs含量的影响 将胡萝卜分为四组,分别置于-4、0、4 ℃的条件下进行冷诱导48 h,同时以常温(25 ℃)作为对照,考察温度对CISPs含量的影响。

1.2.2.2 冷诱导时间对CISPs含量的影响 将胡萝卜分为四组,在-4 ℃的条件下分别冷诱导7、11、15 d,以冷冻诱导0 d为对照组,考察冷诱导时间对CISPs含量的影响。

1.2.3 蛋白含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 分别吸取酪蛋白标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L,加入考马斯亮蓝试剂,于595 nm波长下测定吸光度值。以酪蛋白浓度(mg/mL)为横坐标(x),吸光度值(A)为纵坐标(y),绘制标准曲线。

1.2.3.2 胡萝卜蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝比色法,精确吸取CISPs溶液1 mL与4 mL考马斯亮蓝G250溶液充分混匀,静置5 min,于595 nm波长处测定吸光度,测定样品中蛋白质的含量。

1.2.4 CISPs分子质量的测定 采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳法:以低相对分子质量标准蛋白质标定样品的相对分子质量,测定冰提后的粗蛋白质的相对分子质量分布。SDS-PAGE凝胶采用张延红等[16]的方法配制。整个电泳胶板由4 g/dL的浓缩胶(pH6.8)和12 g/dL的分离胶(pH8.8)组成。按表配成凝胶贮液,凝胶固定后,将样品与上样缓冲液混合均匀后上样。通过Quantity One软件分析电泳结果。

1.2.5 小麦淀粉凝胶的制备及CISPs对淀粉凝胶质地的影响

1.2.5.1 小麦淀粉凝胶的制备 参考杨玉玲等[17]的方法制作淀粉凝胶,将小麦淀粉配制成8%的淀粉凝胶,于90 ℃水浴锅中加热,用玻璃棒持续搅拌20 min,待淀粉凝胶呈黏胶状时停止水浴加热,冷却备用。

1.2.5.2 冻融淀粉凝胶样品的制备 分别向冷却后的淀粉凝胶中添加0%、0.75%、1.5%的CISPs冻干粉,混匀后倒入塑料小瓶中,分组标记并保持小瓶水平状态置于冰箱中,以24 h为一个冻融周期,于-18 ℃分别冷冻0、24、72、120 h,即进行0、1、3、5个冻融周期。

1.2.5.3 淀粉凝胶析水率的测定 采用Hon等[18]的方法,将制备好的淀粉凝胶于5000 r/min下离心20 min,弃去上清液后,用滤纸按压以吸取沉淀物的水分,称取沉淀物质量,记录析水率。析水率计算公式如下:

1.2.5.4 淀粉凝胶的质构特性检测 利用TA-XT2i质构仪,检测不同冻融时间以及不同CISPs添加量对冷冻小麦淀粉凝胶的硬度、弹性、黏聚性、胶着性以及咀嚼性的影响。

质构仪参数设定:探头类型为50 mm圆柱探头,探测前速度为1 mm/s,测试后探头回程速度10 mm/s,时间3.00 s,触发力5.00 g,应变位移70.00%,引发距离2.00 mm。探头压缩部位为胶体的中心部位(保持淀粉凝胶的完整性,防止冻融后淀粉凝胶破损或者表面不平整导致实验结果出现误差),压缩至样品原高度的40%,每组样品平行测定3次取平均值。

1.3 数据处理

实验重复3次,实验数据经SPSS 17.0软件分析,在0.05水平上对实验结果进行差异显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 酪蛋白标准曲线

从图1中可以得出,酪蛋白标准曲线方程y=0.519x-0.0183,R2为0.9998。可用于后续实验对胡萝卜提取液中蛋白含量的测定。

图1 酪蛋白标准曲线Fig.1 Casein standard curve

2.2 CISPs的冷诱导

以CISPs含量为指标,通过检测不同冷诱导温度及冷诱导时间对CISPs的影响,确定最佳冷诱导时间及温度。

2.2.1 冷诱导温度对CISPs含量的影响 图2中可以看出,与25 ℃条件下相比,经过48 h的冷诱导使胡萝卜蛋白含量发生了一定规律的变化,变化范围较小。但随着温度的降低,CISPs却呈现出大幅度、规律性的增加,当温度为-4 ℃时CISPs的含量最大,达到0.758 mg/L,较常温胡萝卜增加了89.03%。说明低温冷诱导促进了CISPs的产生,且随着温度降低,CISPs增加。这与操庆庆等[10]的研究结果相似,即低温诱导使CISPs含量和组分发生变化。同时,25 ℃条件下从 胡萝卜蛋白溶液中冰提得到CISPs,含量为0.401 mg/L,可见新鲜胡萝卜体内也同样存在ISPs。Hon等[18]认为,经过低温驯化的冬黑麦叶片中含有具有抑制重结晶能力的ISPs,而对照组中未经低温驯化的冬黑麦叶片中虽含有类似的蛋白,却不具备抑制重结晶能力。研究说明,一些植物ISPs与抗虫抗病等逆境相关蛋白有高度的序列同源性,具有抗冻和抗病双重抗逆活性,即在植物体内的ISPs是同一基因在不同时期的不同表达形式。植物ISPs的表达和积累,既受控于发育及转录因子调节,同时又受到低温、短日照、脱水及乙烯等逆境因素的影响[19]。因此,随着温度的变化,植物体内的不同种特异性蛋白质含量也会随之发生变化,从而导致总蛋白含量的相对变化[20]。在本研究中,在一定温度范围内,随着温度的降低,胡萝卜蛋白和CISPs的含量发生变化,但不存在互补变化关系。说明,冷诱导使胡萝卜体内的蛋白质含量发生了变化,并促进了CISPs的产生与含量增加。综上,确定-4 ℃为冷诱导的适宜温度。

图2 诱导温度对CISPs浓度的影响Fig.2 Effect of induced temperature on CISPs concentration

2.2.2 冷诱导时间对CISPs含量的影响 从图3中可以看出,冰提前胡萝卜蛋白和CISPs都随着冷诱导时间的变化而变化,呈现出先增加后降低的趋势,其中冰提前胡萝卜蛋白在诱导11 d时含量最高、达到1.7 mg/L,较诱导前增加了100%。而CISPs则在7 d时达到最高,为0.936 mg/L,较诱导前增加了114.7%，之后缓慢降低。说明温度的降低对胡萝卜蛋白和CISPs的含量产生影响的同时,低温诱导的时间是重要的影响因素。可见,植物在生长过程中受低温环境的胁迫时,会产生一些特异蛋白、糖、新酶等物质[20],其中由于低温所产生的特异蛋白质的存在与植物的耐寒性密切相关[21]。Guy等[22]在研究日本桃叶珊瑚的抗寒分子机制时发现,低温胁迫下日本桃叶珊瑚产生了一些特异蛋白,它们中的某些组分与抗寒相关。研究表明,虽然植物抗寒相关蛋白来自组成型基因的表达,但经过冷驯化后,一些潜在的、新的与抗寒功能有关的基因mRNA 转录体将会陆续产生并表达,进而合成新的抗寒蛋白质。

图3 -4 ℃条件下冷诱导时间对CISPs浓度的影响Fig.3 Effect of cold induction time on CISPs concentration at -4 ℃

即低温寒冷环境改变了植物细胞内的基因表达途径,从而产生更多的抗寒蛋白质,提高植物的抗寒力。同时,低温增加了细胞膜的流动性,当达到冰冻温度时,在组织细胞间会形成冰晶造成原生质体缩水和渗透压降低,改变了细胞膜电位差。而低温或因寒冷造成的脱水则是植物细胞ISPs表达调控的信号[23]。研究结果佐证了低温条件下,胡萝卜中的蛋白和CISPs含量得以大幅度增加,且在一定范围内随着冷诱导时间的延长,CISPs含量发生增加和波动。这是胡萝卜为抵御低温环境胁迫的应激反应及相关基因不同表达的结果,基于此可以利用冷诱导处理新鲜胡萝卜,增加CISP含量,并提取CISP。

2.3 CISPs的SDS-PAGE分析

由图4B及表1可以看出,运用Quantity One软件进行分析,Marker由7个蛋白组分组成,其分子量分别是:116.000、66.200、45.000、35.000、25.000、18.400、14.400 kDa,与说明书相符。验证了Quantity One软件分析的准确性,可用于CISPs的SDS-PAGE结果分析。由图4C、D、E及表1可知,CISPs由8种蛋白组分组成,其相对平均分子量分别为:133.633、95.570、81.092、67.950、58.053、47.578、36.518、16.164 kD。其中,47.578、36.518、16.164 kD组分条带颜色重,表明该三个组分含量较多。操庆庆等[10]得到的冷诱导胡萝卜蛋白质粗提物的电泳结果显示,在12.5和36 kD分子量处出现疑似抗冻蛋白条带与本研究中CISPs的低分子量组分相似。说明,不同冷诱导温度和不同冷诱导时间下产生的CISPs的组分和分子量不同。

图4 SDS-PAGE及Quantity-one分析图Fig.4 Anclysis dragram of SDS-PAGE and Quantity-one注:A:SDS-PAGE图;B:Marker分子量分析;C,D,E分别是第2、3、4条带分析。

表1 CISPs分子量的Quantity-one分析结果Table1 Results of Quantity-one analysis of molecular weight of CISPs

2.4 冻融时间以及CISPs添加量对淀粉凝胶冻融稳定性的影响

2.4.1 冻融周期对淀粉凝胶析水率的影响 由图5可以看出,随着冻融周期的增加,冷冻淀粉凝胶的析水率呈上升趋势。随着冻融周期的增加,冷冻淀粉凝胶的析水率呈上升趋势。对照组的析水率在第5个冻融周期时达到32.49%,较冷冻前增加了26.55%。而添加CISPs延缓了析水率的增加趋势,不同CISPs的添加量对冷冻淀粉凝胶的析水率影响不同,其中添加1.5%组在第5个冻融周期时析水率为18.71%,较冷冻前增加了12.17%,较对照减缓了14.38%。淀粉凝胶在冷冻境下,由于淀粉链的分子聚集会脱水收缩,导致水分流出。冷冻凝胶淀粉的析水率能够反应其在应对不良物理变化时的能力,析水率的大小与淀粉形成凝胶网状结构有关。可以利用析出的水量作为评价淀粉老化的指标。因此,在本研究中,添加CISPs有效减少了淀粉凝胶的析水率,即减慢了淀粉的老化速率。宁吉英等[24]分析比较了经多次冻融处理后的普通玉米凝胶淀粉析水率的变化情况,测得其析水率超过50%。而谢新华等[25]对亚麻籽胶对糯米淀粉凝胶冻融稳定性影响的研究中,显示亚麻籽胶能显著降低糯米淀粉凝胶的析水率,冻融7次,析水率为7.35%,较对照减缓27.6%。

图5 冻融周期对冷冻淀粉凝胶析水率的影响Fig.5 Effect of freezing and thawing cycle on water-saving rate of frozen starch gel

2.4.2 冻融周期对淀粉凝胶质构特性的影响 由图6～图10可以看出,随着冻融周期的增加,淀粉凝胶的硬度、弹性、黏聚性、胶着性和咀嚼性发生了明显的变化,其中,硬度、胶着性和咀嚼性大幅度增加,弹性和黏聚性明显降低,而CISPs的加入减缓了上述趋势。当CISPs添加量为1.5%时对淀粉凝胶的质构影响较大,达到第5冻融周期时,相较于0%组弹性升高了35.71%、黏聚性升高86%,硬度、胶着性和咀嚼性分别降低了52%、9.43%以及19.51%。在冷冻过程中,引起淀粉凝胶冻融稳定性变化的本质是淀粉凝胶冻融特性的改变[26]。淀粉凝胶经过反复冻融后,其组成、结构和回生难易程度的变化直接影响了淀粉凝胶的硬度、弹性、黏聚性、胶着性和咀嚼性的变化。通过质构仪测定淀粉凝胶的硬度、弹性、黏聚性、胶着性和咀嚼性体现了低温储藏淀粉凝胶的老化程度。即淀粉凝胶的硬度、粘性等的变化与淀粉的老化程度有关,说明淀粉凝胶在冻融过程中加速了淀粉富集区域淀粉分子的结合,反复的冻融循环导致凝胶的硬度增加、弹性和黏聚性降低[27]。冷冻破坏了淀粉凝胶的冻融稳定性。Li等[28]经过研究低温诱导冬小麦草ISPs,将其加入小麦淀粉凝胶后,显著提高了其抗冻稳定性,抑制了重结晶,减小了冻融后淀粉凝胶硬度等特性。这与本研究中,添加CISPs使冷冻淀粉凝胶的硬度、弹性、黏聚性和胶着性的恶化状况减缓,趋势结果相似。说明,添加ISPs能有效保护冷冻淀粉凝胶的冻融稳定性。

图6 冻融周期对冷冻淀粉凝胶硬度的影响Fig.6 Effect of freeze-thaw cycle on the hardness of frozen starch gel

图7 冻融周期对冷冻淀粉凝胶弹性的影响Fig.7 Effect of freeze-thaw cycles on the elasticity of frozen starch gel

图8 冻融周期对冷冻淀粉凝黏聚性的影响Fig.8 Effect of freeze-thaw cycles on the cohesiveness of frozen starch

图9 冻融周期对冷冻淀粉凝胶胶着性的影响Fig.9 Effect of freeze-thaw cycle on the gelation of frozen starch gel

图10 冻融周期对冷冻淀粉凝胶咀嚼性的影响Fig.10 Effect of freezing time on the chewiness of frozen starch gel

ISPs对淀粉凝胶冻融稳定性的保护作用在于,正常条件下淀粉凝胶能够形成稳定的三维网状结构骨架,而冷冻条件下,淀粉凝胶中的水分经冷冻会形成的冰晶结构会对其造成破坏,CISPs能够减少冰晶的形成,同时又能抑制冰晶的重结晶[29]。当淀粉凝胶中形成较小而均匀分布的冰晶,同时对凝胶网络破坏较小,能使凝胶保持较好的质构特性,在受到挤压时也较难破裂使凝胶特性的凝胶硬度和胶粘性增大,而弹性和内聚性减小[30]。贾春利等[31]通过从燕麦粉和女贞叶中提取的热稳定ISPs对淀粉凝胶冻融稳定性的影响,结果表明:女贞叶中的ISPs对冻融后的淀粉凝胶质构质地有较为明显的改善,能够延缓淀粉凝胶硬度的增加以及弹性的减小,添加ISPs后,经冻融的淀粉凝胶的总体品质得到了提高。随着CISPs浓度的增大,淀粉凝胶的组分改变,冻融周期不断增加会使淀粉凝胶表面覆盖过多小冰晶,影响其质构情况。

3 结论

本研究将胡萝卜进行冷诱导提取CISPs,并添加到小麦淀粉凝胶中,进行冻融处理,结论如下:随着温度的降低,CISPs含量增加,-4 ℃时最大、达0.758 mg/L,较诱导前增加了89.03%;随着诱导时间的延长,胡萝卜蛋白和CISPs均呈现规律性的增加,冷诱导11和7 d时二者含量最高,分别达到1.7和0.936 mg/L,较诱导前增加了100%和114.7%。说明低温和一定时间的冷诱导促进了胡萝卜蛋白和CISPs的产生。

通过 SDS-PAGE检测和Quantity-one分析,确定CISPs由8种蛋白组分组成,其相对分子量分别为:133.633、95.570、81.092、67.950、58.053、47.578、36.518、16.164 kDa。

经过冻融处理后,在第5个冻融周期时,添加CISPs的冷冻小麦淀粉凝胶的析水率为18.71%,较对照降低了14.38%;弹性和黏聚性分别升高了35.71%和86%,硬度、胶着性和咀嚼性分别降低了52%、9.43%、19.51%。且当CISPs添加量为1.5%时效果最佳。说明CISPs能有效降低小麦淀粉凝胶的析水率、减缓老化速率,改善其硬度、弹性、黏聚性、胶着性和咀嚼性等物性参数。对冷冻小麦淀粉凝胶的冻融稳定性具有很好的抗冻保护作用。