乳腺癌患者CTCs、ctDNA检测及其诊断价值研究

季福庆，李梦婓，印玉龙，吕勇刚

西北大学附属医院/西安市第三医院甲乳外科，陕西 西安 710018

乳腺癌在临床上具有较高的发病率，其属于导致女性肿瘤患者发生死亡的主要原因[1]。同时有资料显示，乳腺癌患者的发病年龄呈现出年轻化的趋势，已经成为急需解决的公共卫生问题[2]。目前临床上对乳腺癌患者开展治疗的方法包括手术治疗、放射治疗、化疗以及内分泌治疗等，若患者存在放疗适应证，则在为其开展手术治疗后，实施放射治疗进行辅助，可有效降低患者的疾病复发率[3]。有资料报道称，在乳腺癌疾病转移和复发的过程中，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)和循环肿瘤细胞DNA(circulating tumor cell DNA，ctDNA)均发挥着重要作用[4]。因此通过检测CTCs与ctDNA水平，可为乳腺癌的诊断及预后评估起到积极作用[5]。本研究旨在探讨乳腺癌患者CTCs、ctDNA的检测水平及其诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017 年1 月至2019 年1 月西北大学附属医院收治的乳腺癌患者60 例作为观察组，选取同期在我院接受体检的女性健康者50例作为对照组。观察组患者年龄22～75岁，平均(51.8±6.1)岁；病理分期中，Ⅰ期5 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期25 例；绝经前35 例，绝经后25 例。对照组健康者年龄21～77 岁，平均(51.8±6.5)岁；绝经前30例，绝经后20例。两组受检者的年龄和绝经情况比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，受检者均知情并签署同意书。

1.2 病例选择 纳入标准：(1)乳腺癌经术后病理检查或穿刺活检确诊；(2)具备完整临床资料及影像学资料；(3)乳腺癌患者病灶未出现转移。排除标准：(1)机体存在其他恶性肿瘤疾病者；(2)凝血功能异常者；(3)肝肾功能严重障碍者；(4)先天性心脏疾病患者；(5)入组前近期行内分泌外相关治疗的患者。

1.3 观察指标 比较不同特征患者及对照组受检者的CTCs阳性率与ctDNA水平，包括TNM分期为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期，M 分期为M0 期与M1 期，浸润型导管癌与浸润型小叶癌，＞50岁与≤50岁患者。

1.4 检测方法 采集所有受检者肘静脉血7.5 mL，应用肝素实施抗凝处理，在冷却10 min后采用5 mL磷酸缓冲盐溶液稀释，加入淋巴细胞分离液3 mL，离心取血清，加入磷酸缓冲盐溶液2 mL，混合均匀后离心，去除上清液，加入波形蛋白抗体、细胞角蛋白抗体、CD45各0.5 μL 后混匀，静置30 min，离心后实施检测。采用流失细胞分析术开展分析，依靠侧向反散射对前向散射做二维散射点，然后设立R1门，同时应用CD45-细胞，根据侧向反散射对细胞角蛋白进行二维散射点制作，并应用细胞角蛋白（+）细胞设置R2门。应用R2门细胞通过波形蛋白对上皮细胞黏附分子进行二维散射点制作，采用上皮细胞黏附分子(+)和波形蛋白(+)进行R3 门制作，从而获取散点图，对数据开展分析。若检查结果显示波形蛋白(+)、CD45(-)、上皮细胞黏附分子(+)以及细胞角蛋白(+)，则可判定为阳性，若CTCs 水平在5/7.5 mL 及以上，则可判定为转移阳性。采集晨起空腹静脉血5 mL，放入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管内，离心机中以1 600 r/min速度离心10 min，采集上层血浆，将其装入离心管内，离心管容量为2 mL，将下层血细胞放入到冻存管内，则得到检测所需要的血细胞。血浆放入离心机中实施离心处理，残余细胞去除后，将上清液转入到离心管内，则得到所需要的血浆，保存于冰箱内待检。应用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 操作流程开展血浆游离DNA提取，实施传统DNA测序。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0 统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差()表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的CTCs阳性率比较 观察组患者 的CTCs 阳性率为38.33% (23/60)，ctDNA 水平为(152.6±12.4)ng/mL；对照组CTCs均为阴性，ctDNA水平为(28.1±4.3) ng/mL，观察组CTCs 阳性率与ctDNA水平明显高于对照组，差异均具有统计学意义(t=67.644，P=0.001)。

2.2 观察组不同特征患者的CTCs 阳性率和ctDNA 水平比较 不同年龄与病理类型乳腺癌患者的CTCs阳性率与ctDNA水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；不同乳腺癌TNM 分期患者CTCs 阳性率与ctDNA水平比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 观察组不同特征患者的CTCs阳性率和ctDNA水平比较

3 讨论

乳腺癌是女性高发恶性肿瘤，主要特征为乳头回缩、乳房皮肤橘皮样改变和乳头溢液等[6]。以往临床上主要采用乳房切除联合腋窝淋巴结清扫术对患者进行治疗，对机体创伤大，手术时间长，容易产生多种并发症，且术后乳房美观度差，影响患者的身心健康[7]。近年来，保留乳房手术逐渐受到患者的青睐，同时可达到和传统手术相似的治疗效果，可明显提高患者术后生活质量[8]。

在乳腺癌的诊断方面，临床上主要通过传统影像学检查和组织学检查。但是，临床研究显示传统的诊断措施对患者的诊断敏感性不高。近年来随着液体活检技术的不断发展，CTCs 检测和ctDNA 检测在临床上的应用率不断提升。ctDNA 属于新型肿瘤标志物，通过对外周血中传统DNA 总量进行测量，或检测特定基因发生，可能会为肿瘤疾病的疗效评价及预后评估提供参考[9-10]。有研究人员通过选取乳腺癌患者，分别为其开展糖类抗原153、CTCs、影像学检查与ctDNA检测，评估4种检测方法所具备的敏感度，结果显示ctDNA 可对疾病状况进行更为高效的反映[11]。同时也有资料报道称，通过对转移性乳腺癌与卵巢癌患者的血ctDNA 水平实施检测，可使疾病的临床进程得到有效反映[12]。当机体处于健康状态时，外周血内的ctDNA 水平较低，通常为3～63 ng/mL，而当机体出现肿瘤时，由于循环癌细胞发生坏死和凋亡，将会导致血液内的DNA 水平明显升高，从而使ctDNA 水平明显高于健康人群，其浓度通常可达到122～462 ng/mL[13]。

相较于传统影像学检查和组织学检查，CTCs 检测和ctDNA 检测的敏感性更高，可重复性好。在对CTCs实施检测时，需做好细胞检测与富集工作，可应用的检测方法种类多，包括细胞检测、流式细胞检测、核酸检测与免疫细胞化学检测，富集方法包括黏附分离法、密度梯度离心法与免疫磁珠分离法。本研究结果显示，对照组CTCs 均为阴性，ctDNA 水平为(28.1±4.3)ng/mL，观察组CTCs阳性率与ctDNA水平明显高于对照组。有资料报道称，对于早期乳腺癌患者而言，其能够从辅助治疗中受益的比例达到接近30%，而对于晚期转移乳腺癌患者而言，也可在其机体外周血内检测到CTCs，因此通过对患者的CTCs 进行检测，可为患者的疾病分期提供参考。本次研究结果显示，M1期乳腺癌患者的CTCs阳性率明显高于M0期乳腺癌患者，同时CTCs阳性率在不同TNM分期乳腺癌患者中也具有明显差异化。

本研究结果显示，不同年龄与病理类型乳腺癌患者的CTCs 阳性率与ctDNA 水平无明显差异；不同乳腺癌TNM 分期患者CTCs 阳性率与ctDNA 水平具有明显差异。提示随着乳腺癌分期的改变，患者机体内的CTCs 阳性率与ctDNA 水平会出现明显变化，因此通过对CTCs 阳性率与ctDNA 水平进行检测，可为患者的疾病分期提供一定参考，从而可使患者的疾病治疗更具有针对性。同时有资料报道称，在肿瘤疗效评估中CTCs 也可发挥一定价值，相较于ctDNA，CTCs检测可对完整的肿瘤细胞进行提供，可采用多种RNA、DNA 与蛋白质组学测量方法，对癌症过程进行全面了解[14-15]。但CTCs 的应用过程中存在稀释以及分离困难等情况，因此当患者的疾病处于早期阶段时，难以在血浆中发现CTCs，当患者的疾病发生转移后，血浆中的CTCs 数量才会明显增加，从而也使得CTCs 的检测应用受到一定限制[16]。同时有资料报道称，CTCs与匹配肿瘤细胞间具有一定差异，因此也可能对其分子生物学特征的可靠性产生一定影响[17]。因此在检测过程中，将CTCs与ctDNA进行联合应用，可有效提升诊断的准确性和可靠性[18]。

综上所述，CTC与ctDNA检测可为乳腺癌的诊断提供有效参考，可作为乳腺癌临床诊断的有效指标。