EGFR、ALK、p53蛋白的表达在肺腺癌预后评估中的价值

唐微，谭凌峰，以敏

广西医科大学第四附属医院柳州市工人医院病理科，广西 柳州 545005

肺癌在当今世界最常见的恶性肿瘤中高居首位，近几十年来，随着全球生态环境的恶化，肺癌的发病率逐年递增，特别是肺腺癌，发病率的上升趋势更明显[1-2]，严重威胁着全球人类的健康与生命。肺腺癌早期没有明显的临床症状，发生发展难以预测，早期肺腺癌多数在体检时发现，出现症状的肺癌患者大部分已经是晚期，预后较差，死亡率高[3-4]。国内外学者研究了多种与肺癌相关的细胞因子，但有些结果却不太一致，出现这种结果的原因主要是因为样本数量、研究方法的不同以及肿瘤自身所具有的异质性造成的。表皮样生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是HER/erB 蛋白家族成员之一，编码跨膜酪氨酸激酶，参与细胞的生长与分化等过程[5]。有研究显示胃癌及乳腺癌中EGFR过度表达预示其生存期短、预后较差，且EGFR突变与非小细胞肺癌发生发展密切相关，是其主要的致癌基因驱动因子[6]。因此，检测肺腺癌组织中EGFR的表达并分析其与肺腺癌临床病理特征之间的关系有助于了解其在肺癌发生发展中的可能作用机制。间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是受体酪氨酸激酶胰岛素受体超家族的成员之一，位于染色体2P23，其发病机制通常源于染色体的重排。研究发现，部分肺癌患者发生染色体2P倒位，使ALK基因和棘皮动物微管相关蛋白样基因EML4发生融合，从而导致肺癌的发生发展[7-8]。因此研究并鉴定肺腺癌进程中的关键蛋白ALK的表达对肺癌的预后发展及评估十分重要。p53蛋白原是肿瘤抑制基因p53的表达产物，p53基因的突变或缺失被认为是导致多种肿瘤发生的原因[9]。很多研究发现p53突变与卵巢浆液性肿瘤、乳腺肿瘤、胃肠道肿瘤及呼吸道肿瘤等多种肿瘤的发生、进展、转移以及治疗的耐药性相关，被认为是预后不良的因素[10]。因此研究肺腺癌发展进程中p53蛋白的变化十分直观且重要。本实验通过研究肺腺癌和肺炎组织中EGFR、ALK 和p53 的表达差异，EGFR、ALK 和p53 与肺腺癌临床病理特征的关系及其三者之间的相关性，探讨他们在肺腺癌的发生发展及预后评估中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取柳州市工人医院病理科2015 年5 月至2017 年8 月的肺腺癌标本106 例(肺腺癌组)，肺炎性病变标本63 例(肺炎组)，所有标本均经病理确诊，均为病理科包埋好的组织石蜡块。肺腺癌组标本中，男性58 例，女性48 例；年龄30～76 岁，其中≥60 岁51 例，＜60 岁55 例；高分化腺癌33 例，中低分化腺癌73 例；无淋巴结转移60 例，有淋巴结转移46例；临床分期为Ⅰ+Ⅱ期者43例，Ⅲ+Ⅳ期者63例。

1.2 试剂及方法 采用SP法进行免疫组织化学染色，操作过程包括切片、烤片脱蜡、脱水、灭活内源性过氧化物酶、抗原修复、抗体孵化、DAB 显色、复染、封片等，以PBS 液代替一抗作阴性对照。EGFR 抗体、p53抗体及SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。ALK抗体检测试剂盒购自罗氏公司，采用增强DAB检测试剂盒和增强扩增试剂盒染色。

1.3 结果判读 在光学显微镜下对EGFR、ALK和p53蛋白的表达情况进行判读，EGFR蛋白表达判读标准如下：根据肿瘤细胞染色的强弱程度评分，不着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；根据肿瘤细胞阳性百分比计分，肿瘤细胞阳性率＜10%计0分，10%～40%计1分，41%～70%计2分，＞70%计3分，按着色强度和肿瘤细胞阳性百分比两项得分相乘划分为两组：阴性为0～4分，阳性表达为6～9分。ALK抗体的表达根据着色的强弱程度判读：肿瘤细胞存在很强的颗粒状胞浆染色(任何百分比的阳性肿瘤细胞)为阳性，肿瘤细胞内不存在强颗粒状胞浆染色为阴性。p53抗体的表达根据着色的强弱程度及百分比判读：淡黄色或棕黄色强弱不等着色且阳性细胞率＜60%为阴性，棕黄色或棕褐色一致性着色且阳性细胞率＞60%为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0 统计学软件进行数据分析，计数资料以百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验；相关性采用Spearman 相关分析；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组标本中的EGFR、ALK 和p53 表达水平比较 EGFR 在肺腺癌的阳性表达在癌细胞胞膜或浆，呈棕褐色；ALK 在肺腺癌中的阳性表达在癌细胞胞浆，呈颗粒状的棕褐色强着色；p53在肺腺癌中的阳性表达在细胞核，呈一致性的棕褐色强染色。EGFR、ALK和p53在肺腺癌组织中的阳性表达率均高于肺炎组织，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1和图1。

2.2 肺癌组织中EGFR、ALK 和p53 的表达与临床病理特征的关系 EGFR 在肺腺癌组织中的表达与年龄无显著性相关(P＞0.05)，但与性别、分化程度、临床分期及淋巴结转移显著相关，在女性、中低分化、临床分期为Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移的肺腺癌组织中EGFR的阳性表达率高于男性、高分化、临床分期为Ⅰ～Ⅱ期及淋巴结无转移的肺腺癌组织，两者差异有统计学意义(P＜0.05)；ALK 和p53 在肺腺癌组织中的表达与年龄、性别无显著性相关(P＞0.05)，但与肺腺癌分化程度、临床分期及淋巴结转移显著相关，在中低分化、临床分期为Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移的肺腺癌组织中，ALK、p53 的阳性表达率高于高分化、临床分期为Ⅰ～Ⅱ期及淋巴结无转移的肺腺癌组织，两者差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2～表4。

表1 两组标本中的EGFR、ALK和p53表达水平比较[例(%)]

图1 EGFR、ALK和p53在肺腺癌组织中的阳性表达(×100)

表2 EGFR的表达与肺腺癌不同临床病理特征的关系(例)

表3 ALK的表达与肺腺癌不同临床病理特征的关系(例)

表4 p53的表达与肺腺癌不同临床病理特征的关系(例)

2.3 EGFR、ALK和p53在肺腺癌组织中表达的相关性 经Spearman等级相关分析，EGFR和ALK在肺腺癌组织中的表达呈负相关(P＜0.05)。EGFR和p53在肺腺癌组织中的表达呈正相关(P＜0.05)。ALK和p53在肺腺癌组织中的表达呈正相关(P＜0.05)，见表5～表7。

表5 EGFR与ALK在肺腺癌组织中的表达及两者的相关性(例)

表7 ALK与p53在肺腺癌组织中的表达及两者的相关性(例)

3 讨论

我国的肺癌发病率及死亡率近年来增长较快，且治愈率较低。国内外学者在肺癌的发生发展机制及其药物治疗等方面做了大量研究，表明肺癌的发生发展是一个涉及多因素多因子的复杂过程。找到影响肺癌预后的突变基因，评估这些突变基因对肺癌预后的意义，并针对这些突变基因找到有效的靶向治疗药物十分重要。

EGFR是一个分子量为170 kDa的跨膜糖蛋白，其被配体激活后与许多恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关。大量研究表明EGFR的过表达及其基因突变在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、结直肠癌及胶质瘤等肿瘤的发生发展及转移中发挥重要作用，与肿瘤预后和化疗药物的敏感性相关[11-12]。本实验结果显示，在肺腺癌组织中EGFR 的阳性表达率显著高于肺炎组织，且与肺腺癌的分化程度、临床分期及淋巴结转移密切相关，在中低分化、临床分期为中晚期和有淋巴结转移的肺腺癌组织中EGFR 的阳性表达率明显增高。提示EGFR 的表达与肺腺癌的预后关系密切，其阳性表达随肺腺癌的恶性程度增加而增加，可作为预后不良的参考指标。在不吸烟或少吸烟的女性肺腺癌患者中EGFR基因突变比男性患者更常见。本实验结果同样显示，女性患者肺腺癌组织中EGFR 的阳性表达率明显高于男性患者，进一步证实了这一结论。

ALK是一种Ⅰ型膜糖蛋白，正常仅在神经系统中低水平表达，当其发生基因重排或基因融合后，与肺非小细胞癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎症性肌纤维母细胞肿瘤等多种肿瘤的发生发展密切相关，被认为是这些肿瘤的主要致瘤驱动基因之一。非小细胞肺癌患者染色体的异位可使ALK基因与EML4基因发生融合，EML4-ALK 融合基因具有催化活性，被认为是导致非小细胞肺癌发生发展的重要原因，且ALK基因与EML4基因发生融合的肺癌患者相较其他分子类型肺癌预后更差[13-15]。p53基因定位于17号染色体，当其发生激活或缺失突变后，变成促进肿瘤发生发展的癌基因，与多种肿瘤的发生发展相关，可作为肿瘤预后的指标之一[16]。有研究显示，ALK与p53同时突变的肺癌患者比ALK与p53单突变的肺癌患者预后更差[17]。本实验结果显示，ALK和p53在肺腺癌组织中的阳性表达率明显高于肺炎组织，且与患者分化程度、临床分期及淋巴结转移密切相关，在中低分化、临床分期为中晚期及有淋巴结转移的肺腺癌组织中ALK 和p53的阳性表达率明显增高，且ALK 和p53 双阳性的均为临床分期为中晚期且有淋巴结转移的肺腺癌患者，提示ALK 和p53 的阳性表达率会随着肺癌的严重程度增加而增高，揭示ALK 和p53 的表达与肺腺癌的预后转归可能正向关联，且证实了ALK 与p53同时突变的肺癌患者比ALK与p53单突变的肺癌患者预后更差。

对于EGFR、ALK 和p53 在肺腺癌中表达的相关性，目前研究结果不太一致，有研究认为EGFR突变肺腺癌和ALK阳性肺腺癌是两种相对独立的、发病机制不同的肺腺癌的分子亚型[18]。本实验结果显示，EGFR和ALK在肺腺癌组织中的表达呈负相关，推测EGFR和ALK 可能通过激活不同的信号通路导致肺腺癌的发生发展，两条通路之间可能具有拮抗作用。EGFR和p53 在肺腺癌中的阳性表达呈正相关，ALK 和p53在肺腺癌中的阳性表达呈正相关。推测EGFR、ALK与p53在肺腺癌的发生发展及转移中可能具有协同作用，共同促进肺腺癌的发生发展及转移。

综上所述，EGFR、ALK 和p53 在肺腺癌中的表达均高于肺炎组织，且与肺腺癌的严重程度呈正向关联，EGFR、ALK 和p53 的阳性表达提示预后不良，在肺腺癌预后评估中具有重要参考价值，且三者的表达具有相关性，可能在肺癌发生发展及转移过程中相互协同、相互调节。针对这些蛋白的表达评估肺腺癌患者的预后，有选择性的使用靶向治疗药物，对肺腺癌患者的治疗及预后评估具有重要意义。