小龙虾虾壳副产物制备甲壳素的研究进展

母运龙，张 崟*，张龙翼，柯 欢，郭添荣,2，李 慧

(1成都大学肉类加工四川省重点实验室，四川 成都 610106；2.成都市食品药品检验研究院，四川 成都 610000)

小龙虾，学名克氏原螯虾，是一种高蛋白、低脂肪、低胆固醇的营养食品[1]。2018年全国的小龙虾养殖量达163.8万t[2]。小龙虾可食用部分约占体重的30%，其余的70%主要是副产物虾头和虾壳。消费这些小龙虾会产生小龙虾副产物114.6万t，如此多的副产物，如果不能得到有效利用，不仅会带来环境污染问题，而且是对生物资源的极大浪费。小龙虾的虾头和虾壳中含有大量的甲壳素，具有良好的回收再利用价值。

甲壳素在食品、化妆品和生物医学等领域具有很好的潜在应用价值[3]。在食品中，甲壳素可作增稠剂、抗氧化剂和抗菌剂等；在化妆品中，甲壳素和抗氧化成分结合，可用于防止太阳辐射；在工业上，甲壳素可用于高强度生物材料。低分子甲壳素对某些特定的肿瘤细胞或细菌菌株具有很强的抗菌活性，可作为潜在药物成分和药物载体[4]，也可将其制成手术缝合线或止血材料。为了进一步促进小龙虾副产物的综合利用，本文总结了近年来国内外利用小龙虾虾壳制备甲壳素的研究进展，以期为小龙虾消费产生的副产物的综合利用提供参考。

1 小龙虾产业现状

近年来，随着国民经济的不断提高，越来越多的家庭在追求高质量的生活方式，同时也更加热衷于特色小吃食品。在此背景下，小龙虾以其良好的色泽和独特的口味，深受全国各地消费者的喜爱。由此也引发了全国范围内小龙虾养殖量的不断增加。

我国的小龙虾养殖产量自2013年以来逐渐增加，尤其在2016年以后，小龙虾的养殖量出现快速增长。据统计测算，2016年经济总产值1466.10亿，其中，养殖业产值占38.48%、加工业产值占6.96%、服务业产值占54.57%。2018年，我国小龙虾的产量约为2016年的2倍多，小龙虾带来的经济产值达3690亿元。由此可见，小龙虾产业在地方经济发展中起到重要的引擎作用，可以带动整个一二三产业的发展。

2 小龙虾副产物的利用现状

鉴于小龙虾在带动地方经济发展中的重要作用，各地都很重视小龙虾产业的发展，使小龙虾的养殖规模不断增加。因此，小龙虾消费带来的副产物综合利用问题必须得到高度重视。目前，在小龙虾副产物利用方面，国内仅有少部分小龙虾虾壳被回收。通常是对虾壳进行漂洗、烘干、粉碎、消毒等处理后，制成虾壳粉，然后制作成饲料添加物等形式出售[5]。从资源高附加值利用角度来看，利用虾壳提取甲壳素是更好的选择。因为甲壳素及其衍生物，可以广泛应用于化学、医疗、食品等多个领域。这对大规模虾壳副产物的高附加值利用非常有利[6]。目前，国内用于提取小龙虾虾壳中甲壳素的方法主要有微生物发酵法、离子液体提取法、酸碱提取法、化学法和EDTA法等[7]。近年来，国内外研究人员对采用这几种方法制备甲壳素的工艺进行的深入研究。

2.1 微生物发酵法

微生物发酵法就是利用一些细菌和真菌发酵体产生的有机酸或蛋白酶，来去除蛋白质和钙盐，从而实现制取甲壳素的目的。李永强[8]在利用凝结芽孢杆菌和蛋白酶K协同发酵虾壳，得到约93%的蛋白质去除率和91%的灰分去除率的甲壳素。张成菲[9]利用研磨粉碎的虾蟹下脚料，在其中接种5%～10%的混合菌群，培养发酵后分离得到甲壳素。该方法操作简单，极大的降低了生产成本，减少了环境污染，实现了虾蟹加工下脚料的高值化利用。Rut Aranday-García等[10]利用虾渣经短乳杆菌接种或与寡孢根霉联合培通过固态培养(SSC)获得甲壳素。Islem Younes等[11]采用Mojavensis a21粗蛋白酶脱除虾壳中的蛋白，脱蛋白率为88%±5%。Rawia F. Gamal等[12]从土壤中分离出70株细菌，对其进行了蛋白水解酶生产试验。其中最有效的一种是枯草芽孢杆菌，它被用于从虾壳废物中提取甲壳素。在蔗糖浓度(5%)、悬浮物浓度(12.5%)、接种量(10%，含35×108CFU/mL)和发酵时间(7d)下，脱蛋白率96.0%和脱矿率82.1%。Thirumalai Maruthiah等[13]从海洋沉积物中分离得到嗜盐耐有机溶剂蛋白酶(HOSP)的嗜盐副球菌APCMST-CS5，该菌产生的嗜盐耐有机溶剂蛋白酶能有效地去蛋白质化(85.64%)，得到虾壳甲壳素。

Marwa Hamdi等[14]从梭子蟹和对虾的内脏中分离得到酪蛋白粗酶，该酶对青蟹和虾壳脱有较好的脱蛋白效果，生产甲壳素有较好的效果。在50℃孵育3h后，酶和底物比为5U/mg的蛋白质达到最佳的脱蛋白效率(分别为84.69±0.65%和91.06±1.40%)。Chien Thang Doan等[15]在甲壳素生产过程中，发现碱性蛋白酶是一种很有潜力的替代品。分离并分析了一种不含甲壳素酶的细胞外蛋白酶即黑芽孢杆菌TKU046，用于液态发酵虾渣脱蛋白试验。用该菌对虾类废弃物进行脱蛋白试验，发酵4d后蛋白质去除率达95%。Hongcai Zhang等[16]为了在大规模深层发酵条件下制备甲壳素和壳聚糖，采用粘质沙雷氏菌B742、植物乳杆菌ATCC 8014和日本根霉M193连续三步发酵制备虾壳粉。同时，对发酵过程中的关键参数进行了研究，以监测发酵过程中产物的变化。结果表明，制备的甲壳素和壳聚糖的收率分别为21.35%和13.11%，回收率分别为74.67%和63.42%。所得壳聚糖的脱乙酰度为81.23%，分子质量为512.06kDa。用FT-IR和XRD对所得甲壳素进行了表征。所建立的微生物发酵法可用于甲壳素和壳聚糖的工业化大规模生产，同时大大减少了化学试剂的使用。

几种微生物发酵法脱蛋白率的比较见下表1。通过表中的比较，可以看出短乳杆菌和寡孢根霉菌联用脱蛋白率最高，可以进一步优化制得高纯度的甲壳素。微生物发酵法是一种很有发展潜力的提取方法，应该继续探究发现更多、更高效的发酵微生物。

表1 微生物发酵法使用酶或菌的种类及脱蛋白率

2.2 离子液体提取法

离子液体具有高溶解性，Qin Y等[17-18]首次提出了运用离子液体(IL)1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐提取甲壳素的方法。连海兰等[19]将处理后的虾蟹壳粉按一定质量比加入到利用氯化胆碱、硫脲制备的低共熔离子液体中，加热搅拌反应一段时间后，以水作为反相溶剂，通过离心、分离、干燥得到甲壳素。该方法具有处理条件温和，提取工艺简单，反应易于控制的特点，同时低共熔离子液成本低，可回收再利用，减少环境污染，降低能源消耗。吕兴梅等[20]利用虾蟹壳粉末与季铵盐离子液体混合、加热搅拌，通过季铵盐离子液体将虾蟹壳中的碳酸钙和蛋白质等杂质溶解去除，而后将虾蟹壳中不溶于季铵盐离子液体的甲壳素水洗、冷冻干燥得到纯度90±2%的甲壳素成品。吕兴梅等[21]又利用低共熔离子液体或其水溶液除去虾壳粉中碳酸钙，得到除钙虾壳粉。再利用咪唑类离子液体去除虾壳中的蛋白质和色素，得到了高纯度白色甲壳素。本发明所用除钙和除蛋白离子液体温和，无腐蚀性，无污染，对甲壳素破坏少，所得产品纯度高达97%±2%。国外的Leta Deressa Tolesa等[22]以[DIPEA][Ac]、[DIPEA][P]和[DMBA][Ac]为溶剂，在较温和的操作条件下，从虾壳中提取甲壳素。在110℃下提取24 h，虾壳饲料的收率可达14%，在脱乙酰度较高的碱性条件下，提取的甲壳素也成功转化为壳聚糖。吕兴梅等[23]再次利用低共熔离子液体或其水溶液除去虾壳粉中碳酸钙，得到除钙虾壳粉；然后用磷酸酯类离子液体脱去除钙虾壳粉中的蛋白质，得不溶物，即得纯度为72%±8%甲壳素产品。吕兴梅等[24]通过利用柠檬酸两步除钙法，结合利用可降解离子液体溶解除钙虾蟹壳中的蛋白质，使得虾蟹壳中的甲壳素得以分离，与此同时得到的柠檬酸钙是食品钙强化剂，可产生除甲壳素之外的高附加值产品，并且还分离得到了蛋白质，实现了废弃虾蟹壳的全组分、高值化利用，不产生环境污染，解决了现有虾蟹壳制备甲壳素技术中使用盐酸除钙和碱除蛋白造成的环境问题，具有广泛的工业应用前景。

几种离子液体提取法纯度或提取率的比较见下表2。通过表中的数据比较，可以看出低共熔离子液体和咪唑类离子液体联用的提取法得到的纯度最高，可以作为高纯度甲壳素的一种提取方法；氨基离子液体有着较高的提取率，值得继续研究优化，以期能够实现工业生产。

表2 离子液体提取法使用的离子液体种类及纯度或提取率

2.3 酸碱提取法

酸碱法主要包括脱矿、脱蛋白和脱色3个步骤，简单高效，但要消耗大量的酸碱。韩晓梅等[25]以虾壳为原料，在20伏电压，先用1%NaCl制备的酸性电解水脱矿物质6h后再用碱性电解水脱蛋白质6h，得到甲壳素的提取率为19.46%，矿物质脱除率为99.64%，蛋白质脱除率为97.99%，且节省盐酸使用量96.48%。国外的Varun等[26]采用化学萃取法，从蟹壳废料中提取甲壳素，产率达到12.2%。蓝尉冰等[27]采用微波消解辅助法制备甲壳素。制得的甲壳素脱蛋白率70.85%，脱钙率为91.26%,甲壳素得率为26.34%±0.24%,较大程度上减少了酸碱液的使用量，减少了对环境的影响程度，但是在一定程度上提高了生产成本，对于大规模的工业化生产还需要进行进一步的研究。Jie Zhang等[28]提出了一种新的一步无碱法，用盐酸从蟹壳中制备甲壳素。蟹壳脱盐在几分钟内完成，而脱蛋白至少需要180min才能获得高纯度产品。所得的低分子量甲壳素分子量为53～80kDa，纯度高达92%。它具有与商品化甲壳素相同的原始α-同构晶体结构。制备条件优化为：酸浓度3～5wt%，温度110℃，时间180～600min，这是一个简单的无碱制备蟹壳壳低分子量甲壳素的方法。该方法可推广应用于其它甲壳动物的外骨骼，如虾壳、蛹和昆虫等。

2.4 EDTA法

根据pH13时EDTA-Ca的lgk′=lgk的特征，且EDTA的溶解度接近最大[29]的特点可用EDTA来制取甲壳素，在此工艺中EDTA可循环利用，有效地降低了成本，减少了污染。窦勇等[30]采用EDTA法提取了淡水小龙虾头中的甲壳素，试验表明以13%的EDTA溶液作提取剂，在pH12、反应25min、投料比1∶15(g/mL)、30℃的最适条件下，提取率达24.05%，反应前后的脱钙和脱蛋白率分别达到了100.0%和98.6%；随后，在EDTA方法的基础上，窦勇等[31]又采用了超声辅助的方法，在功率180W、超声频率60kHz、超声反应45min、pH13、EDTA浓度18%、处理温度30℃、料液比1∶24(g/mL)的最佳条件下，提取灰分含量为0.13%，含氮量为3.51%。孟凡欣等[32]采用了期望函数和响应面法优化了EDTA法提取虾壳中甲壳素的工艺：脱钙条件pH11，EDTA浓度11%，反应时间2h，料液比1∶14(g/mL)，10g虾壳粉中平均可提出2.57g(干重)甲壳素，相对于未优化的工艺提高了20.3%。

2.5 甘油提取法

热甘油预处理法能够快速、高效地从虾壳中分离甲壳素。废虾壳在热甘油中的预处理能够通过脱水和温度诱导的碎片去除蛋白质，形成低分子量水溶性碎片，随后通过溶于水从壳基质中去除。Ramamoorthy等[33]开发了一种更绿色的方案：用热甘油预处理虾壳，随后用柠檬酸研磨，能够在一个步骤中除去蛋白质和矿物质。光谱和热分析表明，此方法制取的甲壳素的质量优于常规化学法。连海兰等[34]利用过100目以下虾蟹壳粉，将甘油和盐酸溶液混合置于反应容器中，室温搅拌均匀后备用；将得到的虾蟹壳粉与混合溶剂按质量比混合，反应得到产物；将得到的反应产物加入蒸馏水并冷却，在高速离心机上按设定速度、设定时间离心，反复水洗到接近中性，将沉淀物烘干后即得到甲壳素。这种方法产品质量高；用水量少；能源消耗少；减少废气排放量；产品质量由优于化学法；热甘油可回收利用；方法简单、可扩展、可持续。具有很好的研究前景。

2.6 强化常压等离子体法

强化常压等离子体法采用常压介质阻挡放电等离子体对甲壳类废弃物进行预处理，强化了蛋白质的去除。M. Boric等[35]利用DBD等离子体处理过程显示出高效、快速的蛋白质去除能力，对甲壳素生物聚合物没有显著影响。此外，基于等离子体的工艺不需要任何溶剂，因此不会形成(固体和液体)废物。使用相对便宜的气态O2/N2混合物，在大气压下工作，而不使用任何昂贵的真空组件，可以直接扩大这项技术的规模。

几种提取方法的优缺点比较见下表3。通过表中的比较，可以看出离子液体提取法、EDTA法和甘油提取法得到质量较高的甲壳素，但是短期内不适合工业化生产。微生物发酵法和强化常压等离子体法能耗小，成本低，有较好的发展前景，应加快研究进程，以期能够尽快投入工业化生产。

表 3 甲壳素提取方法优缺点比较

3 小龙虾壳制备甲壳素存在的问题

目前我国部分废弃小龙虾虾壳被应用于甲壳素的制备，不仅使废弃的小龙虾壳得到了充分的利用，同时还大大地减轻了环境的污染压力。但是我国利用小龙虾壳制备甲壳素的方法还存在一些问题。

(1)绝大多数都是采用化学酸碱法 由于传统的酸碱法会产生大量对环境造成一定危害的酸碱废液，而且在使用酸碱液时会破坏溶出的蛋白质，会导致一部分副产品被浪费。虽然已经有部分研究者提出用微波、超声波等技术辅助改进提取工艺或者尝试新的酸碱液来减少带来的损失。但就微波辅助而言，已有的研究未注重在相同的水浴和微波升温曲线条件下提取甲壳素的质量问题，所以得到的结果与传统方法提取甲壳素的可比性不大。就提出的无碱制备甲壳素的方法，虽然能够减少一定量的环境污染，但是同样存在提取时间过长和破坏蛋白质的问题。

(2)微生物发酵法有着较好的发展前景 近年来较多研究者不断的探索寻找能够快速高效地把虾壳制备成甲壳素的菌类，特别是国外对微生物发酵法十分的重视，已经找出了几种菌类来制备甲壳素。而且目前研究出的粘质沙雷氏菌B742、植物乳杆菌ATCC 8014、日本根霉M193和黑芽孢杆菌TKU046都有建立的微生物发酵法可用于甲壳素和壳聚糖的工业化大规模生产。但还是存在酸和蛋白质产量不足的问题。

(3)离子液体提取法最近几年也被受重视 尤其是国内一些学者开发出了一系列的离子液体用于甲壳素的提取。最新研发出的低共熔离子液体和咪唑类离子液体结合柠檬酸两步除钙法使得虾蟹壳中的甲壳素得以分离，与此同时得到的柠檬酸钙是食品钙强化剂，可产生除甲壳素之外的高附加值产品，并且还能分离得到优质蛋白质，实现对废弃虾蟹壳的全组分、高值化利用，变废为宝，不产生环境污染，解决了现有虾蟹壳制备甲壳素技术中使用盐酸除钙和碱除蛋白造成的环境污染问题，具有广泛的工业应用前景。但是对于离子液体提取法仍然仅停留在实验室研发阶段，其工艺参数与实际生产还有较大的差距。

(4)EDTA法和热甘油预处理法 适合长期的大批量生产，尤其热甘油预处理法有望成为代替酸碱法成为工业生产的支柱。

4 结语

我国是小龙虾消费大国，充分挖掘小龙虾虾壳的潜在价值，对于实现小龙虾副产物充分利用和减缓环境污染问题有着双重意义。利用虾壳制备甲壳素，我们应该注重于更加经济环保提取工艺的探究，比如微生物发酵法和离子液体法，但是实验室研究是微量且精细化的，与实际的工业化大规模生产之间存在诸多不同，如果要将已有的实验研究成果转化为工业生产，还需要进行大量的放大实验，并在放大实验的过程中制定产品品控标准，并随之调整相应的工艺条件。虽然小龙虾制备甲壳素的研究在近几年有了一定的进步，但还应继续加大研究力度，使之产业化，为我国的小龙虾产业健康可持续发展作出贡献。