恒温扩增法快速检测结核分枝杆菌复合群的临床应用

韩珍，朱惠慧，范远珍

(惠州市职业病防治院检验科，广东 惠州 516008)

结核病是由结核分枝杆菌感染而引起的慢性传染性疾病。虽然其病因、诊断、治疗方法都已经相对明确，但随着耐药结核病的不断流行，结核病防治仍然是世界范围内的难题[1-2]。因此，尽早发现和治疗结核病是目前临床工作中的重点。

目前临床上常用检测痰样本中结核分枝杆菌的方法有痰涂片法和罗氏培养法，痰涂片法简单快捷，但敏感性却相对较低；而罗氏培养法则常被认为是结核分枝杆菌检测的金标准，但其检测耗时2～8 w，过程繁琐且对实验室条件要求较高，难以在临床实验室，尤其是不发达地区的临床实验室中常规开展。恒温扩增荧光法一种结核分枝杆菌快速分子诊断技术，采用恒温荧光扩增技术，可实现在60 min内判定病患标本是否含有结核分枝杆菌，较传统检测方法有更高的检出率，是一种快速、高灵敏、高特异性的检测技术，极有可能替代传统的痰涂片法和罗氏培养法而在临床实验室中开展[3-4]。本研究拟对本所1000例已确诊肺结核患者的痰标本同时使用3种方法(痰涂片法、罗氏培养法、恒温扩增荧光法)进行结核分枝杆菌检测，对这3种方法检测结果的阳性率进行比较；分析恒温扩增荧光法与罗氏培养法的检测结果一致性；比较3种检测方法在临床使用中的优缺点，为临床工作中对结核分枝杆菌检测的方法选择提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象 以2018年1月至2019年5月期间在惠州市结核病防治研究所结核科就诊的1000名肺结核患者为研究对象，采集晨痰标本，每份标本不低于2 mL，共1000份。

1.2 检测方法

1.2.1 痰涂片法和罗氏培养法 痰涂片法(Zhiel-Neelsen染色法)和罗氏培养法(L-J培养基)的具体操作参考2015版中华医学会《结核病实验室检验规程》和中国防痨协会《结核病诊断细菌学检验规程》[5-6]。

1.2.2 恒温扩增荧光法 操作中使用的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒(恒温扩增法)和实时恒温荧光检测仪(DEAOU-308C，国食药监械(准)字2013第3402079号、粤械注准 20142400245)均来自广州迪澳生物公司。具体步骤如下：(1)标本处理：痰样本的分离、预处理方法与罗氏培养法相同，均参考《结核病实验室检验规程》和《结核病诊断细菌学检验规程》。将待测标本按11 400 rpm离心5 min，弃上清液；加入生理盐水1 mL进行洗涤，弃上清液；加入50 μL TB稀释液重悬后，300 W超声处理15 min，并按11 400 rpm离心5 min后备用；(2)扩增检测：取处理物2 μL，加入30 μL扩增检测液。将微量反应管置于恒温荧光检测仪中，按63 ℃ 45 min的程序进行恒温扩增反应(扩增程序设定方法详见恒温荧光检测仪308C使用说明书)。结束并完成结果判读后，将反应管(闭管)小心从检测仪中取出放入密封袋，将封口封严，按污染源处理；(3)结果判读：点击检测仪的“检测结果”按钮查看检测结果，样本曲线与阈值曲线交叉点的横坐标读数为出峰时间dt,若dt≤35 min则为阳性；dt﹥40 min则为阴性；若35 min﹤dt≤ 40 min则重复检测，以复测值为准。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行分析。3种检测方法的阳性率比较采用χ2检验；3种检测方法的一致性评价采用采用Kappa检验(0.4

2 结 果

2.1 3种方法的检测阳性率比较 对1000例已确诊肺结核病人的痰样本进行结核杆菌检测，同时采用传统痰涂片法、罗氏培养法和恒温扩增荧光法，3种方法的阳性率(灵敏度)分别为44.7%、55.4%和70.3%。恒温扩增荧光法阳性率显著高于传统痰涂片法(χ2=134.1，P﹤0.01)、及罗氏培养法(χ2=47.5，P﹤0.01)，且差异均有统计学意义，见表1。

表1 痰涂片法、罗氏培养法、恒温扩增荧光法检测结果比较

注：*痰涂片法：Zhiel-Neelsen染色法；**罗氏培养法：L-J培养基

2.2 恒温扩增荧光法与罗氏培养法的一致性检验

临床上常以罗氏(L-J)培养法得到结核分枝杆菌作为诊断结核病的“金标准”，因此在本研究中，我们将恒温扩增荧光法与罗氏培养法的结果进行了一致性分析。由表可见，Kappa值为0.592，且P﹤0.01，可以认为两种检测方法的结果具有中等程度的一致性，见表2。

3 讨 论

我国肺结核发病率居世界第二位，但在临床上，由于既往检测方法的缺陷，我国的结核发现率却较低。近年来，针对结核分枝杆菌的分子检测方法，尤其是恒温扩增荧光检测法，由于其简单、便捷、高效的特点，受到了越来越多的关注。本研究采集了1000名肺结核患者的晨痰样本，同时采用3种方法对痰样本中的结核分枝杆菌进行检测，结果发现恒温扩增荧光法的检测阳性率显著高于其他方法，且其与临床金标准(罗氏培养法)的检测结果具有中等程度的一致性。

表2 恒温扩增荧光法与罗氏培养法的一致性分析

本研究中传统痰涂片法、罗氏培养法和恒温扩增荧光法的阳性率(灵敏度)分别为44.7%、55.4%和70.3%，这一结果与既往多数研究相符合。既往的研究痰涂片法阳性率多在20.0%～57.1%间；罗氏培养法多在27.9%～47.5%之间[7-8]；而恒温扩增荧光法多在46.8%～71.4%之间[9-10]。此外，本研究发现恒温扩增荧光法的阳性率显著高于传统涂片法和罗氏培养法，这与既往研究基本一致[7-8]389-391，498-499。值得注意的是，本研究发现恒温扩增荧光法与罗氏培养法的检测结果有中等程度的一致性(Kappa=0.592，P﹤0.01)，但一致性并不是很高。我们认为这是因为在临床应用中，培养法的敏感性、特异性不高，因而导致恒温扩增荧光法与培养法的检测结果符合率并不是很高，因此Kappa值仅有0.592，并未达到较高的一致性。

恒温扩增荧光法是基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立起来的，通过特异的引物与结核分枝杆菌的DNA特定区域结合，采用多对引物，在恒温条件下进行扩增的分子检测方法。近年来，不少研究者分析对比了其与传统检测方法的优缺点，以期为临床工作中检测方法的选择提供依据。从单次检测耗时来看，传统痰涂片法、恒温扩增荧光法、罗氏培养法单次检测耗时分别为10 min、60 min和2～8 w，见表3。可以看到，痰涂片法耗时最少但敏感度低，易漏诊。罗氏培养法耗时最多，敏感度高于痰涂片法，但其繁琐的操作和极长的检测耗时限制了其在临床中的应用。恒温扩增荧光法单次检测耗时仅需60 min，且检测敏感度最高。在结果读取方面，传统痰涂片和罗氏培养法都受到操作者主观的影响，而恒温扩增荧光法则通过客观数据来确定结果。在3种方法的操作过程中，操作者感染结核杆菌的风险在恒温扩增荧光法中是最低的，见表3。

表3 恒温扩增荧光检测与痰涂片法、罗氏培养法的比较

综上所述，恒温扩增荧光法的检测敏感度显著高于痰涂片法和罗氏培养法法，且其检测结果与罗氏培养法有中等程度的一致性。恒温扩增荧光法阳性率高、准确性好、耗时短、操作简单，适于在临床推广使用，有利于早期发现和早期治疗结核病，以取得更好的治疗效果。