高效液相色谱法检测大鼠脑内肌肽含量

赵善志，李佳恒，吴润蕊，李炎，杜佳睿，王麟冉，赵艳

(锦州医科大学，辽宁 锦州 121000)

肌肽是一种由内源性β-丙氨酸和L-组氨酸组成的水溶性二肽，在哺乳动物易兴奋的组织如肌肉和大脑中高浓度存在。肌肽已被证明参与不同的细胞防御机制，包括抑制蛋白质交联、活性氧和氮类解毒以及对抗炎症。在许多与氧化应激和炎症相关的疾病中起着关键作用，如动脉粥样硬化、糖尿病和神经退行性疾病[1]。越来越多的研究表明肌肽能够明显改善阿尔兹海默症[2]、帕金森症[3]、糖尿病及其并发症[4]，脑内肌肽浓度与这些疾病密切相关。但脑内肌肽浓度是如何调节的仍不确定[5]，因此检测脑内肌肽含量具有重要意义。本文采用2，4-二硝基氟苯作为衍生试剂，建立了反相高效液相色谱法检测大鼠脑内肌肽含量的方法，为研究生物体内肌肽的变化规律提供了行之有效的借鉴。

1 仪器与材料

1.1 仪器

日本岛津LC-10Avp高效液相色谱仪(包括泵、柱温箱、紫外检测器)；德国Sigma 2-16PK冷冻离心机；JY92-Ⅱ型超声波粉碎机(宁波新芝科器研究所)；PS-20A超声波清洗器(上海煜南仪器有限公司)；TJ-600电热恒温水箱(江苏同君仪器科技有限公司)。

1.2 试剂与动物

肌肽标准品(98.0%)、2，4-二硝基氟苯为Sigma公司产品；乙腈、三氟乙酸为色谱纯；醋酸、醋酸钠、硼酸、硼砂均为国产分析纯。SD大鼠，体重250～300 g，雌雄各半，由锦州医科大学实验动物中心提供。

2 方 法

2.1 标准品与供试品溶液的配制

肌肽标准品溶液的制备：称取肌肽标准品5 mg，加双蒸水稀释至100 mL，即得50 mg/L肌肽对照品贮备溶液。将肌肽标准储备溶液用水分别稀释至10 mL容量瓶，配制成含肌肽质量浓度分别为20.00、10.00、5.00、2.50 mg/L及1.25 mg/L的肌肽标准品溶液；大鼠脑组织供试品溶液的制备[6]：称取大鼠脑组织30～50 mg，放入适量的烧杯中，加双蒸水1 mL后，用超声粉碎机粉碎。超声15次，每次5 s，间隔5 s，功率200 W。然后加入三氟乙酸10 μL，旋涡混匀后，4 ℃离心15 min，15 000 rpm，取出上清，用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.2 硼酸-硼砂缓冲溶液的制备

将0.2 moL/L的硼酸溶液和0.05 moL/L的硼砂溶液按体积比1∶4混合配制得 pH为9的硼酸-硼砂缓冲溶液。

2.3 空白对照品溶液的衍生化[7]

取双蒸馏水1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，分别加入硼酸-硼砂缓冲溶液 5 mL、2，4-二硝基氟苯 0.5 mg，混匀后放入水浴箱中100 ℃水浴1 h，室温中冷却后，用硼酸-硼砂缓冲溶液定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

2.4 标准品溶液和供试品溶液的衍生化[7]376-378

分别精密称取肌肽标准品溶液和供试品溶液 1.0 mL置于10 mL量瓶中，分别加入硼酸-硼砂缓冲盐溶液 5 mL、2，4-二硝基氟苯 0.5 mg，混匀后放入水浴箱中100 ℃水浴1 h，室温中冷却后，用硼酸-硼砂缓冲溶液定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。

2.5 高效液相色谱分析条件[7]376-378

色谱柱：Kromail C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.15 moL/L醋酸钠缓冲溶液(1∶5，V∶V)；紫外检测器检测波长：360 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。

3 结果与分析

3.1 流动相的优化

在流动相优化过程中，考察了甲醇-水、乙腈-水两个流动相体系，结果乙腈-水的分离效果较好，避免了衍生试剂峰的影响，把水换成醋酸钠缓冲液并且调整比例后，又更好地改善了肌肽峰的拖尾现象。因此选择用乙腈-0.15 moL/L醋酸钠缓冲溶液(1∶5，V∶V)作为流动相。

3.2 检测波长的优化

查阅文献，将肌肽标准品与2，4-二硝基氟苯衍生化后，通过紫外检测器扫描，发现在360 nm处肌肽衍生物有最大的紫外吸收，灵敏度最高，因此选择360 nm作为检测波长。

3.3 方法学的考察

3.3.1 专属性实验 分别取肌肽对照品溶液与供试品溶液按“2.4”方法衍生化后，0.45 μm微孔滤膜过滤，按照“2.5”的色谱条件各进样10 μL分析，考察衍生试剂峰是否干扰肌肽的检测。结果显示衍生试剂峰与肌肽峰之间分离度大于 1.5，且色谱峰峰形对称，理论塔板数可达5000，色谱图见图1。

色谱峰1、2：2，4-二硝基氟苯；色谱峰3：肌肽图1 空白对照品高效液相色谱图(A)，肌肽标准品高效液相色谱图(B)，供试品高效液相色谱图(C)

3.3.2 线性关系考查 取20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg/L的肌肽标准品溶液，按照“2.4”方法衍生化后，分别精密量取10 μL，按照“2.5”的色谱条件检测，以肌肽标准品溶液的浓度(X)与相应的峰面积(Y)进行线性回归，计算得回归方程为：Y=413.55X-25，R2=0.9994。说明肌肽在1.25～20.00 mg/L范围内与其峰面积线性关系良好。

3.3.3 精密度试验 取5.00 mg/L的肌肽标准品溶液衍生化后，按“2.5”的色谱条件重复进样5次，计算肌肽衍生物峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果RSD为 1.27%。

3.3.4 重复性试验 分别精密称取5份大鼠脑组织，按照“2.1”方法平行制备肌肽供试品溶液5 份，衍生化反应后按“2.5”的色谱条件进行高效液相色谱分析，结果大鼠脑组织肌肽含量的RSD为1.88%。

3.3.5 稳定性试验 取供试品溶液3份，分别衍生化反应后于室温下放置，精密吸取10 μL，于 0、6、12、24 h按“2.5”条色谱条件进样分析。结果测得衍生物峰面积的RSD为0.99%，表明供试品溶液衍生反应后于室温下放置24 h内稳定。

3.3.6 加标回收率试验 精密称取已测定肌肽含量的供试品溶液9份，分别准确加入肌肽对照品，分三个添加水平各制备3份，衍生化反应后按“2.5”的色谱条件进行高效液相色谱分析，计算加标回收率。本方法的加标回收率在94.1%～100.4%之间，见表1。

3.4 大鼠脑组织中肌肽含量的检测

分别取大鼠的大脑皮层和海马组织30～50 mg，按“2.1”方法制备供试品溶液，按照“2.4”方法衍生化反应后，0.45 μm微孔滤膜过滤，各进样10 μL，按“2.5”条色谱条件进样测定，按外标法计算肌肽含量，见表2。

表1 肌肽加标回收率(n=3)

表2 大鼠脑组织中肌肽含量的检测

4 讨 论

目前肌肽的检测尚无国家相关标准。文献报道，肌肽含量测定有离子交换色谱法[8]、HPLC法[9]及毛细管电泳法[10]，但毛细管电泳法对样品分离纯化要求较高，缓冲体系的pH值较难控制，重现性差。HPLC法测定肌肽含量有采用荧光检测器测定，但由于紫外检测器比较容易获得，所以本文采用2，4-二硝基氟苯对肌肽进行了衍生化反应，选用Kromail C18反相色谱柱、紫外检测器来测定肌肽含量。本方法成本较低、易于实现，而且稳定性、重现性及分离度均较好，为进一步研究肌肽在生物体内的变化规律提供了行之有效的检测方法。