芒针对骨关节炎大鼠炎症反应及镇痛作用影响的机制研究*

范 洁，胡凤军，王 波，姜迎萍△

(1．新疆维吾尔自治区中医医院，新疆 乌鲁木齐830001; 2．广州市正骨医院，广东 广州510045)

骨关节炎( Osteoarthritis，OA) 是一种多因素造成的关节软骨退化、关节畸形等退行性病变［1－2］。近年来由于我国人口老龄化加重，OA 的发病率逐年升高［3］。研究表明OA 的发生与发展和机体炎症反应密切相关，减少病变组织炎症反应能显著减轻关节的继发性损伤并促进运动功能的恢复［4］。中医中药在OA的对症治疗中取得了长足的进展，龙胆苦苷、黄芪甲苷、南蛇藤素、黄连素、淫羊藿等越来越多的中药单体成分被证明在抑制OA 的早期炎症反应中发挥重要作用［5］，另一方面，针灸治疗OA 具有操作方便、疗效显著、无毒副作用等优点，温针、火针、电针等针灸疗法均已普遍应用于OA 患者的临床治疗中［6－7］，而芒针作为传统针灸的一部分，其对OA 的治疗效果及作用机制尚不明确。本实验通过建立骨关节炎大鼠模型，探讨芒针对OA 大鼠炎症反应及镇痛作用的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1．1 实验材料

华佗牌0．25 mm×40 mm 针灸针( 苏州医疗用品厂有限公司) ;泰盟PL－200 型热刺痛仪( 成都泰盟科技有限公司) ; von Frey hair 纤毛机械刺激针( 北京中昊万通科技有限公司) ;JL2B 型电脉冲刺激仪( 苏州医疗用品厂有限公司) ; NO、SOD、MDA 检测试剂盒( 自南京建成生物工程研究所) ; RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒( 碧云天) ; anti － IL －6、anti － TNF － α、anti－iNOS 抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG( CST) ;大鼠IL－6、TNF－α、iNOS ELISA 检测试剂盒( 上海北诺生物) 。

1．2 实验动物

30 只SD 大鼠购自新疆医科大学动物实验中心，体质量(200 ±20) g，分笼饲养于无特定病原体级实验动物中心，实验操作严格遵守动物伦理保护法等相关规定，所有大鼠适应性喂养1 周后分组实验。

1．3 实验分组及造模

将大鼠随机分为正常组、模型组和治疗组，每组10 只。模型组和治疗组大鼠给予5%水合氯醛腹腔麻醉后行仰卧位固定，配制100 mL 含1．6%木瓜蛋白酶溶液和0．3 mol/L 半胱氨酸溶液的混合液，向2 组大鼠双后肢膝关节腔内注射混合液，每3 天造模注射1次，共注射3 次，正常组注射等量生理盐水，同时根据超疲劳易致OA 发病的特点，每天强迫大鼠运动1 ～2 h。造模10 天后，随机选取各组大鼠2 只颈椎脱臼处死，暴露膝关节，取各组大鼠关节组织观察造模是否成功，造模成功后给予治疗组大鼠芒针针灸治疗。

1．4 治疗方法 模型组大鼠造模成功后不予治疗，同时正常组大鼠不做任何处理。治疗组大鼠采用自制固定器仰卧位固定于解剖板，弯曲大鼠双膝呈45°固定。参照世界卫生组织制定的国际标准穴位选取膝前、后三里二穴，针刺部位采用75%酒精常规消毒，取针刺入穴位4 ～5 mm深，捻转1 min，将针灸针连接于JL2B型电脉冲刺激仪上，设置参数为2/100 Hz、1 mA，留针刺激15 min，左右隔次交替。每天治疗1 次，5 天为1个疗程，疗程间隔休息2 天，共治疗2 个疗程。实验完成后采用断髓法处死全部大鼠，收集保存相应组织标本进行后续指标检测。

1．5 大鼠行为学指标检测

1．5．1 热板致痛阈值检测 最后1 个疗程芒针治疗结束后2 h，加热热板维持温度在( 55 ±0．5) ℃，将各组大鼠分别置于热板上，观察从接触热板后1 min 内大鼠舔后足的反应时间，超过1 min 大鼠无明显疼痛反应则取出大鼠终止实验，记录上述各组大鼠的疼痛反应时间为热痛阈值( Paw withdraw ther－mal latency，PWTL) 。

1．5．2 机械性撤足阈值检测 机械性撤足阈值检测采用von Frey hair 方法［8］，热板致痛反应实验结束后平静大鼠恢复至正常状态，1 ～2 h 后将各组大鼠放置于箱底为金属网板的丙烯酸笼内，适应15 ～30 min 后通过网孔采用von Frey hair 纤维丝分别向大鼠两后足底部施加机械性刺激，持续4 ～6 s，观察并记录大鼠受到刺激后是否出现撤足或舔足反应，出现即记为阳性反应，产生阳性反应的最小纤维丝刺激力为大鼠双侧后肢撤足阈值( Paw withdrawal threshold，PWT) 。

1．6 血清NO、SOD、MDA 含量检测

治疗完成后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各组大鼠，固定大鼠并取腹主动脉血3 mL，室温静置2 h后4℃4 000 r/min 低速离心10 min，分离上层血清，分别采用硝酸还原酶法、羟胺法及硫代巴比妥酸( TBA) 法对血清内一氧化氮( NO) 、超氧化物歧化酶( SOD) 及丙二醛( MDA) 含量进行检测，比较各组大鼠血清内NO、SOD、MDA 含量差异。

1．7 HE 染色观察关节软骨组织病理变化

取治疗完成后各组大鼠膝关节软骨组织，采用4%多聚甲醛固定液4℃固定软骨组织12 h 至过夜，12．5%EDTA 溶液脱钙1 ～2 周，取出组织梯度酒精脱水，行常规石蜡包埋冠状面10 mm 连续切片后经苏木素伊红( HE) 染色液染色后于光学显微镜下观察各组大鼠关节软骨组织病理变化情况，取清晰视野拍照保存。

1．8 大鼠软骨组织相关炎性因子表达检测

1．8．1 Western Blot 取实验结束后各组大鼠软骨组织40 ～60 mg 置于5 mL 管中，加入1 mL 含1%蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液充分匀浆研磨，冰浴裂解30 min。裂解完成后4℃12 000 r/min 离心收集蛋白上清，定量后加入1 × loading buffer 100℃变性蛋白5 min。取各组样品等量蛋白行10%SDS －PAGE 凝胶电泳分离目的条带并转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%BSA 封闭孵育1 h，4℃一抗孵育至过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。将条带转移至凝胶成像仪，滴加发光液后曝光成像，拍照统计条带上各组蛋白灰度值。

1．8．2 ELISA 取各组大鼠膝关节软骨组织，充分匀浆裂解15 min，4℃4 000 rpm 低速离心15 min 收集上清。参照双抗夹心ELISA 试剂盒说明书，取等量样品加入反应孔中于37℃水浴45 min，充分洗涤5 次，加入生物素标记的抗体37℃反应30 min，充分洗涤后再加入链霉亲和素－过氧化物酶混匀37℃水浴30 min。加入显色剂避光孵育15 min，终止显色，上酶标仪检测各反应孔于450 nm 波长处吸光值。

1．9 统计学分析

上述全部数据均采用SPSS 19．0 统计软件分析，计量资料以 珋±s 表示，实验重复3 次取均值，两两比较采用独立样本t 检验，组间差异采用单因素方差分析( ANOVA) ，P ＜0．05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 芒针对膝关节软骨组织病理变化的影响

造模后可见模型组大鼠膝关节软骨组织表面凹凸、增生严重，HE 染色显示模型组大鼠软骨细胞数量较正常组显著减少，细胞形态畸变，出现过渡层细胞排列紊乱、组织间隙充血、肿胀、炎性细胞严重浸润等病变现象，提示大鼠OA 模型造模成功。给予芒针治疗后，治疗组大鼠软骨组织肉眼可见表面较为光滑平整，光镜下显示细胞排列有序，与模型组相比，少量可见细胞偏于一侧，炎性细胞浸润显著减少，详见图1。

2．2 芒针对OA 大鼠的镇痛作用

通过热板致痛及von Frey hair 方法比较芒针治疗对OA 大鼠镇痛作用的影响，见表1，结果显示相较于正常组，模型组大鼠热板致痛反应敏感，PWTL 值显著降低( P ＜0．05) ;治疗2 疗程后，芒针施治对大鼠热板致痛反应有明显镇痛作用，大鼠痛阈值较模型组显著增加( P ＜0．05) 。同时，比较3 组大鼠机械撤足阈值( PWT) 结果显示，模型组与治疗组大鼠PWT 值均较正常组显著降低，但治疗组PWT 值较模型组显著增大，差异具有统计学意义( P ＜0．05) 。

2．3 各组大鼠血清NO、SOD、MDA 含量比较

检测血清中NO、SOD、MDA 含量变化以验证3 组大鼠抗自由基损伤作用能力，结果显示，模型组较正常组大鼠血清内NO、MDA 含量显著升高，而SOD 含量减少( P ＜0．05) ，给予芒针治疗后，治疗组大鼠体内NO、MDA 含量较模型组显著降低，但与正常组比较差异有统计学意义( P ＜0．05) ，SOD 含量较模型组显著提升，且与正常组大鼠血清SOD 含量间差异无统计学意义( P ＞0．05) ，芒针促进大鼠体内抗自由基损伤作用增强，详见表2。

图1 HE 染色观察3 组大鼠膝关节软骨组织病理变化(400 ×)

图2 芒针治疗对3 组大鼠膝关节炎性因子表达影响

表1 芒针治疗对3 组大鼠热痛阈值、机械撤足阈值的影响 (珋±s)

表1 芒针治疗对3 组大鼠热痛阈值、机械撤足阈值的影响 (珋±s)

注:与正常组相比，aP ＜0．05;与模型组相比，bP ＜0．05。

组别 n PWTL( s) PWT( g)正常组10 42．61 ±3．17 27．39 ±1．32模型组 10 14．56 ±2．05a 10．75 ±0．96a治疗组 10 29．15 ±4．11ab 18．03 ±2．21 ab

表2 芒针治疗对3 组大鼠血清内NO、SOD、MDA 含量的影响 (珋±s)

表2 芒针治疗对3 组大鼠血清内NO、SOD、MDA 含量的影响 (珋±s)

注:与正常组相比，aP ＜0．05;与模型组相比，bP ＜0．05。

组别 n NO［c/( mmol·kg) ］SOD［ρ/( U·mL) ］MDA［c/( nmol·L) ］正常组10 2．51 ±0．41 161．10 ±11．37 2．06 ±0．70模型组 10 17．38 ±1．78a 129．58 ±14．01a 10．71 ±1．69a治疗组 10 8．38 ±1．19ab 147．62 ±6．88a 6．33 ±1．20 ab

2．4 各组大鼠膝关节炎性因子表达变化

Western Blot 和ELISA 用于检测各组大鼠膝关节软骨组织中炎性介质表达变化，如图2A，WB 结果显示模型组大鼠组织内TNF －α、IL －6 以及iNOS 蛋白表达较正常组大鼠显著增加( P ＜0．05) ，而与模型组相比，治疗组大鼠上述蛋白表达均有减少。ELISA 结果显示芒针治疗后，治疗组大鼠TNF －α、IL －6、iNOS表达较模型组显著降低，与WB 结果一致，各组炎性因子表达见图2B，差异具有统计学意义( P ＜0．05) 。

3 讨论

中医治疗一直是国内临床医治OA 的重要手段［9－10］，从中医理论出发，OA 被归结为“痹证”范畴，血虚风扰、湿郁化热、风寒湿相搏等均有可能成为OA潜在的致病机制，与此同时，根据郭跃等［11］对OA 的辨证论治，将OA 患者证候分为气滞血瘀型、肝脾肾阳虚型、肝肾亏虚型3 类，并根据不同证候的患者提供了不同的治疗方法和手段。芒针发源于古代九针之一的“长针”，具有取穴少、透穴多、针感强、传导快等诸多特点［12］，已被报道在神经系统疾病、胃肠道疾病及妇科疾病中发挥重要作用［13－14］，近期研究表明，芒针可以通过改善脊髓损伤后的炎症反应和细胞凋亡促进脊髓功能修复和后肢运动能力的提升［15］，而关于芒针对OA 患者的治疗机制未见报道，故展开本研究。

伴随OA 的发生发展，膝关节软骨组织及周围骨质代偿性增生、关节滑膜组织的炎症浸润是加剧软骨稳态破坏和膝骨损伤的重要因素，因此维持膝关节骨细胞正常代谢和关节组织形态是治疗过程中的重要考量因素，HE 染色结果显示，芒针给予OA 大鼠治疗2个疗程后，治疗组大鼠膝关节软骨组织病变较模型组显著改善，过渡层细胞形态规则，炎性细胞浸润减少，提示芒针可能通过促进膝关节组织损伤修复，减轻炎症反应，治疗并改善OA 病症。行为学实验表明，芒针促进OA 大鼠镇痛作用增强，治疗组大鼠PWTL 值及PWT 值均较模型组显著升高( P ＜0．05) ，同时PWT 是反应神经根疼痛的常用指标，PWT 的大小与神经根疼痛程度呈显著负相关［16］，本实验结果表明芒针可能通过缓解神经根疼痛提高OA 大鼠PWT 值，促进OA 大鼠镇痛作用增强。另一方面，既往研究表明，体液内高水平的氧自由基是造成骨关节损伤、炎症反应爆发的重要因素［17］，NO 作为一种重要的炎症介质，其在血液中的含量与动物体内炎症反应显著相关，NO 的积聚更会诱发严重的关节损伤［18］; 与此同时，动物体内的自由基与脂质体发生过氧化反应产生的MDA 会对动物体自身产生细胞毒作用，MDA、NO 的超负荷均会对大鼠的炎症反应及生存状态产生重要影响。本研究结果显示，模型组大鼠体内NO、MDA 含量较正常组显著升高，反之SOD 含量显著减少，由此说明OA 大鼠体内抗自由基损伤作用严重减弱，芒针治疗后，治疗组大鼠体内NO、MDA 及SOD 含量变化提示，芒针施治OA大鼠膝前、后三里等穴位能够显著抑制大鼠体内NO、MDA 的产生及积聚，同时促进SOD 含量升高，最终起到清除体内自由基、抑制炎症反应发生的作用。由此，进一步检测OA 大鼠体内iNOS 蛋白的表达，我们发现治疗组大鼠iNOS 表达较模型组显著降低，iNOS 作为机体NOS 活性氮自由基产生的重要催化酶，iNOS 表达的降低进一步解释了芒针抑制NO 的合成机制。同时，IL－6、TNF－α 已被报道参与OA 相关的NF－κB、MAPKs 等信号通路调控［19］，参与诱导无菌性炎症爆发，WB 和ELISA 结果进一步证明了芒针能够显著抑制OA 大鼠膝关节软骨组织IL－6、TNF－α的表达，起到促进免疫调节、抑制炎症反应的作用。

综上所述，本研究根据近部取穴、循经取穴的原则，给予OA 大鼠芒针施治膝前、后三里二穴，益气补血、消炎化瘀，发挥对膝关节软骨组织的局部治疗作用，疗效确切。选穴配穴参照以往的研究报道［20－21］，一方面针刺膝前穴位是对深膝肌群的肌力训练及恢复，能够平衡在OA 的发生发展过程中软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨三者偶联产生的力学平衡失衡现象。另一方面，中医学认为“针必取三里，灸必加关元”，针刺后三里具有疏经通络、强壮身体的作用，临床已将足三里配伍其穴学位，通过电针、水针、激光针灸等用于多种镇痛及经络调理的治疗中。本研究首次选用足三里配伍膝前穴位，采用芒针针灸的方法对骨关节炎大鼠的炎症反应及镇痛作用和机制进行了探究，结果表明该针灸疗法可能与降低软骨组织IL －6、TNF－α、iNOS 的表达、促进大鼠体内抗自由基损伤作用有关，通过抑制炎症反应，发挥OA 大鼠抗炎镇痛、改善膝骨关节功能、缓解骨关节炎病证的作用。