HPLC测定云南不同产地野生与栽培黄草乌中3种双酯型二萜生物碱成分含量

董帅 陈翠玲 朱培芳 周志宏 马晓霞

摘要：目的  采用HPLC測定云南不同产地的野生与栽培黄草乌中滇乌碱、黄草乌碱甲及黄草乌碱丙的含量。方法  采用Extend-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为乙腈、B为40 mmol/L乙酸铵缓冲液（用氨水调pH值至9.00），两相梯度洗脱（0～35 min，35%→55%A;35～40 min，55%A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，波长260 nm。结果  7个产地野生与栽培黄草乌中滇乌碱含量为510.29～1837.44 μg/g，新平产野生黄草乌最高，建水栽培者最低;黄草乌碱甲含量为583.92～4105.45 μg/g，个旧栽培黄草乌（黄皮）最高，建水栽培者最低;黄草乌碱丙含量为79.93～2281.68 μg/g，嵩明产野生黄草乌最高，建水栽培者最低。3种双酯型二萜生物碱总含量为1240.32～5732.09 μg/g。HPLC对比图显示，黄草乌栽培品与野生品成分存在较大差异。结论  黄草乌野生品与栽培品存在明显成分差异，3种双酯型生物碱含量差异很大，不同产地的栽培品之间也有明显差异。

关键词：黄草乌;野生品;栽培品;双酯型二萜生物碱;高效液相色谱法

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）04-0074-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906004

HPLC Determination of Three Diester Diterpenoid Alkaloids of Wild and Cultivated

Aconitum Vilmorinianum Radix from Different Producing Areas in Yunnan Province

DONG Shuai1， CHEN Cuiling2， ZHU Peifang1， ZHOU Zhihong1， MA Xiaoxia1

1.Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. Wuzhou Institute for Food and Drug Control， Wuzhou 543002， China

Abstract： Objective To determine the contents of yunaconitine， vilmorrianine A and vilmorrianine C of wild and cultivated Aconitum Vilmorinianum Radix from different producing areas in Yunnan Province by HPLC. Methods Extend-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used. The mobile phase was consisted of acetonitrile （A）?40 mmol/L ammonium acetate buffer （adjust the pH to 9.00 with ammonia， B） with gradient elution （0?35 min， 35%→55% A; 35?40 min， 55% A） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the wavelength was set at 260 nm. Results The contents of yunaconitine in eight samples of Aconitum Vilmoriniani Radix ranged from 510.29 to 1837.44 μg/g， with the highest in wild materials grown in Xinping and the lowest in materials cultivated in Jianshui. The contents of vilmorrianine A ranged from 583.9 to 4105.45 μg/g， with the highest in materials cultivated in Gejiu with yellow root bark and the lowest in materials cultivated in Jianshui. The contents of vilmorrianine C ranged from 79.93 to 2281.68 μg/g， with the highest in wild materials grown in Songming and the lowest in materials cultivated in Jianshui. The total contents of these three diester diterpenoid alkaloids ranged from 1240.32 to 5732.09 μg/g. There were also notable differences in the constituents between wild and cultivated Aconitum Vilmorinianum Radix. Conclusion The wild and cultivated Aconitum Vilmorinianum Radix have distinct differences both in the constituents and in the contents of the three diester diterpenoid alkaloids. The cultivated materials from different producing areas also exhibit obvious difference in the contents of constituents.

Keywords： Aconitum Vilmorinianum Radix; wild products; cultivated products; diester diterpenoid alkaloids; HPLC

黄草乌Aconitum vilmorinianum Kom.为毛茛科Ranunculaceae乌头属Aconitum多年生藤本植物，生长于海拔2100～2500 m的山地灌丛中，主产于云南中部和西部地区，在四川（会理）及贵州西部亦有分布[1]，其药用部位为根。黄草乌药材味苦、辛、麻，性温，有剧毒，具有祛风散寒、除湿止痛功效，临床用于治疗跌打损伤、风湿关节疼痛、手足厥冷等，收载于2005年版《云南省中药材标准》[2]。由于野生黄草乌遭到过度采挖，其分布区锐减，野生资源濒临枯竭。近年来人工栽培黄草乌获得成功，有效解决了资源供应问题[3-5]，但野生品与栽培品之间的成分差异未引起足够重视。目前云南省种植黄草乌的地区较多，不同产地栽培品的质量差异问题未见相关报道。因此，在前期研究基础上，本试验采用HPLC，以黄草乌中主要双酯型二萜生物碱成分（滇乌碱、黄草乌碱甲和黄草乌碱丙）为检测指标[6]，对云南3个不同地区的黄草乌野生品和4个不同产区的黄草乌栽培品（其中个旧栽培基地有紫皮和黄皮2个品种）进行含量检测，以期为黄草乌药材的规范种植提供依据。

1  仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元泵、DAD检测器、柱温箱、自动进样器），HU-10260F超声清洗仪器（天津市恒奥科技发展有限公司），DFT-200手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司），AUW220D电子分析天平（日本岛津）。

对照品滇乌碱、黄草乌碱甲和黄草乌碱丙，均为本试验室从黄草乌药材中分离得到，经HPLC分析（检测波长260 nm），纯度分别为98.72%、98.38%、98.84%。黄草乌样品经云南中医药大学民族医药学院谭文红主任药师鉴定为毛茛科乌头属植物黄草乌A. vilmorinianum Kom.的根，药材标本存放于云南中医药大学云南省中医药民族医药博物馆，来源信息见表1。乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，乙酸铵、氨水、异丙醇、乙酸乙酯、盐酸均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  溶液制备

2.1.1  对照品溶液

取对照品滇乌碱、黄草乌碱甲、黄草乌碱丙各适量，精密称定，加0.1%盐酸甲醇制成浓度分别为滇乌碱75.60 μg/mL、黄草乌碱甲81.70 μg/mL、黄草乌碱丙78.20 μg/mL的混合溶液。

2.1.2  供试品溶液

黄草乌样品粉碎，过60目筛，得细粉，精密称取2.00 g，置具塞锥形瓶中，加25%氨水3 mL润湿。精密加入萃取溶剂异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再次称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的质量，摇匀，过滤。精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收至干。残渣用0.10%盐酸甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2  色谱条件及系统适用性试验

色谱柱为Zorbax Extend C-18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为乙腈、B为40 mmol/L乙酸铵缓冲液（氨水调pH值至9.00），两相梯度洗脱（0～35 min，35%→55%A;35～45 min，55%A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长260 nm。滇乌碱、黄草乌碱甲和黄草乌碱丙的保留时间分别为21.675、28.749、37.727 min。色谱图见图1。

2.3  方法学考察

2.3.1  线性关系考察

取混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别自动进样2、5、10、15、25 μL，记录色谱图。分别以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得3种成分的回归方程，结果3种成分在各自的范围内线性关系良好，见表2。

2.3.2  精密度试验

取同一混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续自动进样10 μL，共6次，记录色谱图。结果滇乌碱、黄草乌碱甲、黄草乌碱丙的峰面积RSD分别为0.58%、0.69%、0.83%，表明仪器精密度良好。

2.3.3  稳定性试验

取制备好的同一样品（S1）的供试品溶液，室温放置，按“2.2”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样10 μL，记录色谱图。结果滇乌碱、黄草乌碱甲和黄草乌碱丙的峰面积RSD分别为1.69%、1.36%、1.02%，表明供试品溶液中3个待测成分在室温放置24 h内基本稳定。

2.3.4  重复性试验

取同一批号黄草乌样品（S1），分别按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别进样10 μL，测定3个成分含量。结果样品中滇乌碱、黄草乌碱甲和黄草乌碱丙的平均含量分别为678.00、736.00、485.00 μg/g，RSD分别为1.20%、1.33%、1.10%，表明重复性良好。

2.3.5  加样回收率试验

精密称取已知成分含量的黄草乌样品（S1）粉末1.00 g，共6份，分别精密加入一定量的对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算回收率，結果见表3。

2.4  样品测定

按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下条件测定7个不同地区共8批黄草乌样品中滇乌碱、黄草乌碱甲、黄草乌碱丙的含量（以干燥品计），结果见表4。

2.5  色谱图汇总对比

为更直观对比不同黄草乌样品的成分，8个样品的HPLC图汇总见图2。

3  讨论

本研究结果显示，野生黄草乌中黄草乌碱甲含量普遍高于滇乌碱，但二者差异不大，黄草乌碱丙含量仅嵩明产者明显较高，其他两产地均低。栽培品中，黄草乌碱丙含量普遍较低，但黄草乌碱甲和滇乌碱的含量没有规律性，泸西种植基地和个旧种植基地样品（黄皮）的黄草乌碱甲含量约为滇乌碱的3倍，禄劝和建水的栽培品中二者含量接近，但均较低，而个旧种植基地样品（紫皮）的滇乌碱含量明显高于黄草乌碱甲。从3种成分的总含量来看，不同产地栽培品之间的差异程度大于不同产地野生品之间的差异。可见人工种植的产地选择对黄草乌主要成分含量的影响非常明显。紫皮与黄皮黄草乌成分差异的根本原因还需进一步研究。

从HPLC汇总图看，黄草乌栽培品在黄草乌碱甲峰之后均出现一个含量不低的未知成分峰，此物质在3个产地的野生品中含量均很低。在黄草乌碱丙峰前后观察到2个未知成分峰，它们在栽培品中的含量均高于野生品。可见，人工栽培会导致黄草乌中一些成分含量明显升高。由于乌头属植物遗传变异丰富[7]，因此有必要对这些差异性成分进行研究，明确其化学本质及对黄草乌药效和毒性的影响。

本试验前期对黄草乌野生品的分析条件中，采用流动相A为乙腈、B为40 mmoL/L乙酸铵缓冲液（氨水调pH值至9.0～10.0），两相梯度洗脱（0～30 min，35%→55%A;30～40 min，55%→35%A[6]。由于在栽培品中发现保留时间与黄草乌碱甲非常接近的未知成分，笔者进行了流动相比例调整，并将流动相缓冲盐的pH值确定为9.0。

本试验收集了7个产地的黄草乌样品，经分析发现，其主要毒性成分双酯型二萜生物碱含量有明显差异。目前制药生产中均使用黄草乌栽培品，黄草乌作为一种毒性药材，其毒性成分含量与药物安全性密切相关，因此，是否有必要限定黄草乌的种植区域，还需进一步广泛收集不同产地样品，分析其成分含量，并开展毒性和有效性评价。黄草乌经人工栽培后产生了一些与野生品不同的成分，值得进一步深入研究。

参考文献：

[1] 中国科学院昆明植物研究所.云南植物志（第十一卷）[M].北京：科学出版社，2000：89-91.

[2] 云南省食品药品监督管理局.云南省中药材标准：2005年版第七册[M].昆明：云南科技出版社，2013：69-70.

[3] 李雪佩，何俊，贺水莲，等.黄草乌植物的研究进展[J].西部林业科学， 2017，46（6）：1-7.

[4] 邓廷丰，李培清.云南野生滇南黄草乌人工驯化栽培技术[J].农村实用技术，2001（1）：15-19.

[5] 李明福.滇中黄草乌资源开发及种植技术[J].安徽农业科学，2006（1）：11-12.

[6] 马晓霞，周志宏，谭文红，等.一种同时测定黄草乌药材中3种双酯型二萜生物堿类似物的方法：ZL201510101844.X[P].2016-06-29.

[7] 周天华，黎君，杨恒.乌头及其同属近缘种的SSR指纹图谱研究[J].西北植物学报，2017，37（12）：2378-2388.

（收稿日期：2019-06-01）

（修回日期：2019-06-23;编辑：陈静）

基金项目：国家自然科学基金（81260626）;云南省应用基础研究-中医联合专项（2015FB205-007）

通讯作者：马晓霞，E?mail：13708763980@163.com