酸水解雪松松针总黄酮制备杨梅素工艺的优化

刘东彦杜瑞琴石晓峰∗李 琳

（1.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；3.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030）

雪松Cedrus deodara（Roxb.）Loud.是松科雪松属树种的泛称，包括4 个亚种，而松针为松科植物的多个品种的针状叶，资源丰富，药用历史悠久，具有抗肿瘤、抗病毒、改善记忆、毒杀蚊虫等多种功效［1］。本课题组前期对雪松松针的化学成分和抗肿瘤活性进行了系统的研究，从中分离得到大量以杨梅素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素及其它们的苷类为主的黄酮类化合物［2-5］；对雪松松针中总黄酮及4 种指标成分的含有量进行了测定［6-7］，总黄酮含有量为8.19%，杨梅素含有量为0.022 9%；采用大孔吸附树脂富集纯化得到纯度达54%的雪松松针总黄酮［1，8］；采用MTT法对雪松松针总黄酮进行体外细胞增殖抑制试验［9］，发现其总黄酮具有抗癌活性。

杨梅素是广泛存在于多种天然植物中的一种黄酮类化合物。近年来，许多学者致力于对杨梅素活性方面的研究［10-14］，发现杨梅素具有抗炎、抗肿瘤、降血糖和保肝等多种药理活性。本课题组研究发现杨梅素具有抗肿瘤活性［15］；对杨梅素制剂及其他方面也有研究，如杨梅素分散片、滴丸、微乳和脂质体的研究［16-20］。总之，杨梅素是一个非常有研究价值的天然化合物，本实验通过响应面法对酸水解雪松松针总黄酮制备杨梅素的工艺进行优化，得到产量较高的杨梅素，以期为雪松松针总黄酮中杨梅素的制备及进一步开发利用提供参考。

1 材料

RE-5299 旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；YC-10 多功能提取罐（上海雅程仪器设备有限公司）；CCBLB 树脂柱系统（江阴市金确层析设备有限公司）；AE260 分析天平（万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；Agilent 1100 高效液相色谱仪、Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美国安捷伦公司）；SK3310LHC超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；HH-4 数显恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。

雪松松针于2015 年6 月采自甘肃省陇南市徽县境内，经甘肃省医学科学研究院何福江研究员鉴定为雪松属植物雪松Cedrus deodara（Roxb）G.Don 的松针。

杨梅素对照品（批号100504，纯度大于98%，上海融禾医药科技有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 酸水解雪松松针总黄酮制备杨梅素

2.1.1 雪松松针总黄酮制备［1］称取新鲜雪松松针600 g置多功能提取罐中，第1 次加入13 倍量水，第2 次加10倍量水，回流提取，每次2 h，合并提取液，按比例浓缩，依次用70%、85%乙醇醇沉2 次，回收乙醇至无醇味，加水溶解并定容，得雪松松针水提液。水提液经XAD 7HP 型大孔树脂纯化，控制上样液中总黄酮的质量浓度为6.9 mg／mL，上样体积流量为8 BV／h，上样量为每1 g 树脂2.0 mL上样液，待上样液流完后，用4 BV 水洗脱除杂，再用4 BV 70% 乙醇洗脱，收集乙醇液，减压浓缩并冷冻干燥，即得。

2.1.2 盐酸溶液制备 精密吸取一定体积的浓盐酸，加入50%甲醇，配制成相应质量分数的盐酸溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取雪松松针总黄酮0.1 g，按响应面试验，加入一定质量分数盐酸，于水浴中回流一定时间，冷却，置于100 mL 量瓶中，流动相定容，即得。

2.1.4 对照品溶液制备 精密称取杨梅素对照品1.02 mg，置10 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容，配制成质量浓度为100 μg／mL 的贮备液，精密吸取该贮备液1 mL，置10 mL量瓶中，流动相定容，配制成质量浓度为10 μg／mL 的对照品溶液，备用。

2.2 杨梅素含有量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B）（22∶78）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长360 nm；进样量20 μL。该条件下杨梅素出峰时间为16.2 min，与其杂质峰的分离度＞1.5，理论塔板数不小于7 000，色谱图见图1。

图1 杨梅素HPLC 色谱图

2.2.2 线性关系考察 依次吸取“2.1.4”项下对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 至1 mL量瓶中，流动相定容，摇匀，配制成系列质量浓度的杨梅素对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样20 μL测定。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得到方程为Y＝54.067X+1.745（R2＝0.999 7），表明杨梅素在0.5～6.0 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.3 单因素试验［21］

2.3.1 盐酸质量分数 称取雪松松针总黄酮0.1 g，共4 份，分别加入2%、4%、6%、8% 盐酸溶液30 mL，于95 ℃水浴回流1.5 h，冷却，置于100 mL 量瓶中，流动相定容，按“2.2”项下方法测定，见图2。由图2 可知，不同质量分数盐酸对雪松松针总黄酮水解效果的影响很明显，4%盐酸水解液中杨梅素含有量最高。

2.3.2 料液比 称取雪松松针总黄酮0.1 g，共4 份，分别加入4%盐酸溶液10、20、30、40 mL，于95 ℃水浴回流1.5 h，冷却，置于100 mL 量瓶中，流动相定容，按“2.2”项下方法测定，见图3。由图3 可知，水解液中杨梅素含有量随着料液比的提升呈上升趋势，当料液比为1∶300时趋于最高。

图2 不同质量分数盐酸对杨梅素含有量的影响

2.3.3 水解时间 称取雪松松针总黄酮0.1 g，共4份，加入4% 盐酸溶液30 mL，于95 ℃水浴分别回流0.5、1.0、1.5、2.0 h，冷却，置于100 mL 量瓶中，流动相定容，按“2.2”项下方法测定，见图4。由图4 可知，水解液中杨梅素含有量随着水解时间的提升呈上升趋势，当水解1.5 h 以上时开始降低，因此选用0.5～1.5 h。

图3 不同料液比对杨梅素含有量的影响

图4 不同水解时间对杨梅素含有量的影响

2.4 响应面试验［22］

2.4.1 试验设计 在单因素试验的基础上，选择盐酸质量分数（A）、料液比（B）、水解时间（C）作为影响因素，杨梅素含有量（Y）作为评价指标，设计三因素三水平试验，结果见表1。

表1 试验设计与结果

2.4.2 模型拟合 利用Design-Expert 8.0.5 软件，以杨梅素含有量（Y）为评价指标，对盐酸质量分数（A）、料液比（B）、水解时间（C）进行二次多项式模型方程拟合，得到二元多项回归模型为Y＝0.24-8.250×10-3A+0.012B+0.011C-4.050×10-3AB+1.750× 10-3AC-4.750×10-4BC-0.031A2-0.020B2-0.014C2，（R2＝0.951 7），方差分析见表2。

表2 方差分析

表2 显示，模型P值为0.000 8，达到了极显著水平；决定系数R2＝0.951 7，校正系数＝0.889 7，表明试验结果有88.97% 受到各因素的影响；失拟项P＝0.975 7＞0.05，表明试验数据没有异常点；交互项AB、AC和BC对杨梅素含有量的影响无显著性差异（P＞0.05），表明A、B、C之间交互影响较小；一次项A、B和C与二次项A2、B2和C2均有显著性差异（P＜0.05），表明回归方程能够预测杨梅素含有量变化；各因素影响程度依次为料液比＞水解时间＞盐酸质量分数。

通过软件进行响应面分析，得最优工艺为盐酸质量分数3.71%，料液比1∶330.61，水解时间1.19 h，杨梅素含有量为0.242 8%。

2.4.3 响应面法分析 通过软件作出相应的响应面图和等高线图，见图5。AB响应面图中，B因素的坡度较陡，对杨梅素含有量的影响大于A因素；同法考察AC、BC响应面图，确定各因素对杨梅素含有量的影响程度依次为料液比＞水解时间＞盐酸质量分数，与方差分析结果一致。等高线图的形状反映各因素之间的交互作用，若呈椭圆形，表明两因素的交互作用显著，若呈圆形则不显著，而本实验AB、AC、BC的等高线图均比较圆，表明各因素之间的交互作用对杨梅素含有量的影响不显著。

图5 各因素响应面分析图

2.4.4 验证试验 在实际操作中，将“2.4.2”项下优化工艺参数调整为盐酸质量分数3.7%，料液比1∶330，水解时间1.2 h，杨梅素平均含有量为0.247 6%（n＝3，RSD＝0.798%），与预测值0.242 8%的相对误差为1.94%，表明工艺准确可靠、合理可行。

3 讨论

松针是松科松属植物的针叶，又名松叶、松毛等，为松科植物的主要副产物之一，是一种再生速度快、可持续利用的天然资源。课题组前期从雪松松针提取物中测得杨梅素最高含有量为0.022 9%［7］，游离杨梅素很少，且具有强氧化性，在制备总黄酮过程已损失，纯化后未测出单体杨梅素。课题组前期从雪松松针中分离得到许多杨梅素苷类化合物［2-5］，苷键具有缩醛结构，易被稀酸催化水解，苷键断裂得到杨梅素和糖，雪松松针总黄酮经盐酸水解后杨梅素含有量达0.247 6%，而且在酸性溶液中稳定性好［23］，更有利于进一步纯化。

植物中总黄酮的水解常用甲醇-盐酸体系［24-25］，本实验对比了甲醇-盐酸、50% 甲醇-盐酸、水-盐酸的水解效果，发现甲醇-盐酸体系对雪松松针总黄酮的溶解效果差；水-盐酸体系水解总黄酮后析出不溶物苷元；将同一质量分数的50%甲醇-盐酸和水-盐酸体系进行比较，发现前者水解总黄酮后杨梅素含有量较后者高出1 倍，故本实验采用50%甲醇-盐酸体系进行水解。

本实验建立的酸水解雪松松针总黄酮制备杨梅素的最优工艺为盐酸质量分数3.7%，料液比1∶330，水解时间1.2 h，杨梅素含有量为0.247 6%，与预测值0.242 8% 接近，可知该工艺合理可行，能得到产量较高的杨梅素，并为该成分制备及进一步开发利用提供参考。