HPLC 法同时测定小儿香橘丸中4 种成分

杨 璐王丽琼税丕先∗

（1.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000；2.乐山市食品药品监督稽查支队，四川 乐山 614000；3.乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000）

小儿香橘丸是由木香、陈皮、苍术（米泔炒）、炒白术、茯苓、甘草、白扁豆（去皮）、山药（去皮）、莲子、薏苡仁（麸炒）、炒山楂、炒麦芽、六神曲（麸炒）、姜厚朴、枳实（麸炒）、醋香附、砂仁、法半夏、泽泻19 味药材组成的大蜜丸，功效健脾和胃、消食止泻，临床用于治疗小儿厌食症［1］。方中陈皮、枳实（麸炒）以橙皮苷为指标成分，具有温胃散寒、理气健脾的作用［2］；姜厚朴主要成分为木脂素（和厚朴酚、厚朴酚）［3］，具有抗腹泻作用，可促进胃排空和肠推进，常作为该药材指标化合物［4-6］；醋香附指标成分α-香附酮是其调经解痛的主要有效物质［7］，用于衡量相关制剂质量优劣［8-9］。

中药质量标准提倡多指标成分含有量测定［10-11］，同时其成分复杂，性质差异大，紫外吸收各异，故采用多波长可实现同时检测［12-14］。小儿香橘丸现行标准中的含有量测定部分只涉及橙皮苷［15］，不够完善，故本实验建立HPLC 法同时测定其中橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮的含有量，以期为该制剂质量标准提供参考；在色谱峰定性上，对保留时间差异不大、光谱相似的组分峰采用选定波长处吸收度比值进行区分，取得了满意结果，可为复杂组分的色谱峰定性提供一定思路。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器、自动进样器、OpenLAB CDS 工作站（美国Agilent 公司）；XSE205DU 电子天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B 超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；ULUP-II-10T 优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

橙皮苷（批号110721-201818，纯度96.2%）、和厚朴酚（批号110730-201614，纯度99.3%）、厚朴酚（批号110729-201513，纯度98.8%）、α-香附酮（批号110748-201513，纯度99.7%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。小儿香橘丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，每丸3 g，批号15015420、16015811、16015845）。白扁豆、六神曲（麸炒）经乐山市食品药品检验检测中心朱敏凤主管中药师鉴定为正品，其余13 味对照药材均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯（北京百灵威科技有限公司）；甲醇（成都市科隆化学品有限公司）、磷酸［重庆川东化工（集团）有限公司］为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品贮备液 精密称取橙皮苷对照品66.48 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀；精密称取和厚朴酚对照品13.16 mg、厚朴酚对照品29.08 mg，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀；精密称取α-香附酮对照品10.05 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 对照品溶液 精密吸取“2.1.1”项下橙皮苷对照品贮备液5 mL、和厚朴酚+厚朴酚对照品贮备液5 mL、α-香附酮对照品贮备液2 mL，置于同一100 mL 量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液 丸剂切碎，每份约取6 g，精密称定，加入适量硅藻土，研匀，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 甲醇，称定质量，超声（功率200 W、频率40 kHz）处理1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 阴性样品溶液 按处方工艺，制备缺陈皮、缺枳实、缺厚朴、缺香附的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Welch Ultimate C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.3%磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min，20% A；5～15 min，20%～40%A；15～25 min，40%～74%A；25～37 min，74%A；37～38 min，74%～20%A；38～43 min，20%A）；体积流量1.0 mL／min；检测波长250 nm（α-香附酮）、284 nm（橙皮苷）、290 nm（和厚朴酚、厚朴酚）；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.3 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液色谱图中有与对照品溶液4 种成分对应的色谱峰，相邻峰分离度均大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下橙皮苷对照品贮备液4、2、1 mL，和厚朴酚+厚朴酚对照品贮备液4、2、1 mL，α-香附酮对照品贮备液2、1、0.5 mL，分别置于3 个10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取“2.1.2”项下对照品溶液5、2 mL，分别置于2 个10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，另取对照品溶液（未稀释），以上6 种线性标准溶液在“2.2”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，并以信噪比（S／N＝10）为定量限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定6 次，测得橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮峰面积RSD 分别为0.8%、1.1%、0.8%、0.6%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 重复性试验 取丸剂（批号16015845）适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮含有量RSD 分别为1.5%、1.7%、1.8%、0.9%，表明该方法重复性好。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液（批号16015845）适量，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2”项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮峰面积RSD 分别为1.3%、1.1%、0.8%、0.9%，表明溶液在常温下24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取6 份各成分含量已知的丸剂（批号16015845，橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮含有量分别为2.346 8、0.104 6、0.202 2、0.038 2 mg／g），每份约3 g，精密称定，适量硅藻土研匀后置于具塞锥形瓶中，精密加入“2.1.1”项下橙皮苷对照品贮备液5 mL、和厚朴酚+厚朴酚对照品贮备液1 mL、α-香附酮对照品贮备液0.5 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，共6 份，在“2.2”项色谱条件下各进样10 μL测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 样品含有量测定 取3 批丸剂，每批平行3份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表3。

表3 各成分含量有测定结果（mg／g，n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验参考各成分紫外光谱图，选择多通道检测，于284 nm 波长处检测橙皮苷，290 nm 波长处检测和厚朴酚、厚朴酚，250 nm波长处检测α-香附酮。甲醇（A）-0.3% 磷酸（B）等度洗脱（60∶40）时，橙皮苷色谱峰与相邻色谱峰分离度差，其他3 种成分出峰时间长；梯度洗脱（0～20 min，20%～74% A；20～40 min，74%A）时，橙皮苷色谱峰保留时间约为7 min，与相邻峰分离度差；梯度洗脱（0～5 min，20%A；5～15 min，20%～40%A；15～25 min，40%～74%A；25～37 min，74% A；37～38 min，74%～20%A；38～43 min，20%A）时，橙皮苷色谱峰保留时间约为9 min，与相邻色谱峰分离度符合要求，其他3 种成分出峰时间适中，分离度良好。

3.2 色谱峰确认 本实验以紫外光谱图特征吸收波长与特定波长处吸收度比值作为成分色谱峰确认依据，发现特定波长处吸收度比值能很好地将相似度较高的紫外图谱区分开。其中，样品溶液色谱图中橙皮苷色谱峰保留时间约为12.8 min，其前后2个色谱峰分别为12.4、13.4 min，三者紫外光谱图有较高的相似度，无法区分，均在284 nm 波长处有最大吸收，248 nm 处有最小吸收，但橙皮苷色谱峰吸收度比值为7.970，其他2 个色谱峰依次为4.314、7.099，差异明显，可以区分。

4 结论

随着药材种类、产地、代谢节律的影响［16］，有必要对小儿香橘丸主要药效成分含有量进行控制，而且它作为儿童用药，相关标准应更严格，含有量限度范围不宜过宽。本实验采用HPLC 法同时测定小儿香橘丸中橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮的含有量，并采用直接超声提取，简便快速，专属性好，可用于该制剂质量控制。对同一厂家3 批样品进行检验后发现，橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚、α-香附酮含有量分别为2.346 8～2.547 0、0.098 2～0.104 6、0.193 0～0.202 2、0.031 9～0.038 2 mg／g，总体上较稳定，但就含有量控制限度而言仅3 批远远不够，今后可考虑收集更多批次样品以制定其质量标准。