HPLC 法同时测定外感风寒颗粒中10 种成分

曲颂扬，关 开，周 慧，毛清雯

（1.辽宁中医药大学附属医院药学部，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847）

外感风寒颗粒由桂枝、防风、葛根、白芷、荆芥穗、羌活、柴胡、白芍、桔梗、炒苦杏仁、生姜、甘草12 味药材组成，临床上主要用于风寒感冒、恶寒发热、头痛项强、全身酸疼、鼻塞流清涕、咳嗽、苔薄白、脉浮等病症的治疗［1］。方中桂枝、白芷、羌活发汗解表，祛风散寒，共为君药；辅以防风、葛根、荆芥穗、生姜解肌退热，温肺止咳；炒苦杏仁、柴胡、桔梗、白芍祛痰止咳平喘，生津养血止痛；甘草缓急止痛，调和诸药，诸药合用，共奏解表散寒、退热止咳之功效。

中药及其制剂具有多成分、多靶点的特点，临床疗效为各成分协同作用的结果，单一成分检测难以全面评价其质量，近年来多指标控制模式已逐步应用于相关质量控制中。外感风寒颗粒现行质量标准收载于2015 年版《中国药典》 一部［1］，但仅对葛根素进行了定量测定，未涉及方中君药及其他药味所含成分。本实验参照中药质量标志物以君药为主，兼顾臣药、佐药、使药的原则，选择外感风寒颗粒中君药桂枝所含肉桂酸、桂皮醛，臣药防风所含升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷，葛根所含3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素，佐药炒苦杏仁所含苦杏仁苷作为指标成分，建立HPLC 法同时测定这10 种成分含有量，为全面评价该制剂质量提供依据。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BP-211D 型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；KQ5200 型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

桂皮醛（批号110710-201821，纯度99.6%）、肉桂酸（批号110786-201604，纯度98.8%）、苦杏仁苷（批号110820-201808，纯度88.2%）、葛根素（批号110752-201816，纯度95.4%）、升麻素苷（批号111522-201712，纯度96.2%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201811，纯度97.4%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；3′-羟基葛根素（批号17051825，纯度100.0%）、3′-甲氧基葛根素（批号17032021，纯度99.8%）、升麻素（批号18042043，纯度99.7%）、亥茅酚苷（批号17072821，纯度99.5%）对照品均购自上海同田生物技术股份有限公司。外感风寒颗粒［每袋装 12 g（相当于原药材 12.5 g），批号18090401、18100201、19020602）］来源于华润三九（临清）药业有限公司。桂枝、防风、葛根、白芷、荆芥穗、羌活、柴胡、白芍、桔梗、炒苦杏仁、生姜、甘草均来源于沈阳中药饮片药业有限公司，经辽宁中医药大学附属医院药学部曲颂扬副主任中药师鉴定为正品，符合2015 年版《中国药典》 一部各药材相关要求。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；其他试剂均为分析纯；水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～11.0 min，9.0%A；11.0～17.0 min，9.0%～15.0%A；17.0～32.0 min，15.0%～26.0% A；32.0～50.0 min，26.0%～52.0% A；50.0～61.0 min，52.0%～60.0%A；61.0～70.0 min，60.0%～9.0% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长207 nm［1-3］（0～17.0 min，苦杏仁苷）、254 nm［1，4-10］（17.0～50.0 min，3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷）、280 nm［1，11-13］（50.0～70.0 min，肉桂酸、桂皮醛）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇制成贮备液（苦杏仁苷2.718 mg／mL、3′-羟基葛根素1.152 mg／mL、葛根素3.438 mg／mL、3′-甲氧基葛根素0.974 mg／mL、升麻素苷2.932 mg／mL、升麻素 0.946 mg／mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷1.468 mg／mL、亥茅酚苷0.696 mg／mL、肉桂酸0.192 mg／mL、桂皮醛1.354 mg／mL），各精密量取2.5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得（苦杏仁苷135.9 μg／mL、3′-羟基葛根素57.6 μg／mL、葛根素171.9 μg／mL、3′-甲氧基葛根素48.7 μg／mL、升麻素苷146.6 μg／mL、升麻素47.3 μg／mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷73.4 μg／mL、亥茅酚苷 34.8 μg／mL、肉桂酸9.6 μg／mL、桂皮醛67.7 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取颗粒适量，剪开内包装，倾出内容物后研细，取约2.0 g，精密称定，精密加入25 mL 甲醇，密塞，称定质量，超声（功率200 W、频率40 kHz）处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按颗粒质量标准项下处方比例和工艺过程，分别制备缺苦杏仁、缺葛根、缺防风、缺桂枝的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰基线平稳，均能达到有效分离，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于4 500，阴性无干扰。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品贮备液各2.0 mL，置于25 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，甲醇依次稀释2、5、10、15、20 倍，制成系列质量浓度对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验 取同一供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得苦杏仁苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛峰面积RSD 分别为0.68%、1.13%、0.55%、1.22%、0.71%、1.06%、0.87%、1.31%、1.49%、1.23%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取颗粒适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得苦杏仁苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛含有量RSD 分别为1.08%、1.30%、0.99%、1.46%、1.19%、1.52%、1.25%、1.74%、1.81%、1.63%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、2、4、6、10、16、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得苦杏仁苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛峰面积RSD 分别为0.71%、1.06%、0.58%、1.19%、0.69%、1.03%、0.90%、1.33%、1.47%、1.24%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含有量已知的颗粒（批号18090401）9 份，研细，3 份为1 组，每份约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（苦杏仁苷1.528 mg／mL、3′-羟基葛根素0.654 mg／mL、葛根素1.968 mg／mL、3′-甲氧基葛根素 0.532 mg／mL、升麻素苷1.746 mg／mL、升麻素0.522 mg／mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.838 mg／mL、亥茅酚苷0.396 mg／mL、肉桂酸0.108 mg／mL、桂皮醛0.782 mg／mL）0.5、1.0、1.5 mL 各3 份（约分别相当于样品含的50%、100%、150%），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，苦杏仁苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛平均加样回收率分别为99.46%、98.03%、100.08%、98.54%、99.89%、97.37%、97.89%、96.97%、97.09%、100.00%，RSD 分别为0.96%、1.22%、0.80%、1.37%、0.73%、1.10%、1.45%、0.86%、1.09%、0.95%。

2.4 样品含有量测定 取3 批颗粒（批号18090401、18100201、19020602），研细，各取约2.0 g，精密称定，按“2.2.2”项方法平行制备3份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 讨论

3.1 流动相选择 本实验考察了乙腈-水［1］、甲醇-水［1，7-8］，发现两者均出现不同程度基线漂移，部分待测成分分离不完全，前者相对效果较佳。考虑到磷酸能平稳基线，改善峰形，故又采用乙腈-磷酸［1-3，5，11，14］进行梯度洗脱。通过对磷酸体积分数和洗脱比例不断进行摸索，最终确定乙腈-0.1%磷酸作为流动相，按“2.1”项下比例洗脱，此时各成分色谱图基线平稳，峰形良好，分离效果理想。

3.2 供试品溶液制备方法选择 本实验考察了提取溶剂（甲醇［1，4，7-12］、70% 甲醇、70% 乙醇［2，5］、30%乙醇［1，6］）、提取方式（加热回流［1-2，4-8］、超声［1，11-12］），发现甲醇提取效果优于其他溶剂，超声、加热回流提取率差异不大，可能与各药材均经提取浓缩后制成颗粒有关，同时还考察了提取时间（15、30、45 min）。最终，确定甲醇超声提取30 min作为供试品溶液制备方法。

4 结论

本实验首次采用HPLC 法同时测定外感风寒颗粒中苦杏仁苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷、肉桂酸、桂皮醛的含有量，该方法操作简便，准确度高，专属性强，可为该制剂质量控制提供参考依据，有助于方中原药材产地、采收季节、质量标准的制定及制剂生产工艺参数的不断细化，以确保其质量稳定性和疗效一致性。