CD16/CD13表达模式可以有效鉴别粒细胞相关疾病

王 卉，王爱先，甄军毅，吴雪英，陈 曼，宫美维，宋雨竹，李 兰

(1.河北燕达陆道培医院 检验科，河北 廊坊065201；2.北京旷博生物技术股份有限公司，北京100176)

CD16是流式细胞术检测发育阶段粒细胞常用标志，因其编码基因和抗体的复杂性，一些相关疾病呈现相似又不同的表型，需要加以区分。CD13表达强度随着粒细胞分化成熟而变化，所以CD16/CD13是临床监测粒细胞发育情况的常用抗体组合。本文介绍正常对照以及几种容易误诊的粒细胞相关疾病的CD16及CD16/CD13表达模式，以研究其在鉴别不同疾病中的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂四色 FACSCalibur及八色FACSCanto流式细胞仪均购自美国Becton Dickinson(BD)公司。荧光标记嗜水气单胞菌溶素(Fluorescein-labeled proaerolysin，FLAER)为加拿大CEDARLANE公司产品,其余单抗均为美国BD公司产品(其中CD16为BD Pharmingen产品)。

1.2 标本选择2011年12月到2017年12月在北京市道培医院和河北燕达陆道培医院就诊的病例。随机选取正常对照50例；随机选取骨髓增生异常综合征(MDS)50例；全部夜间阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)62例；全部粒细胞丢失CD16排除MDS和PNH后，疑诊为Fcγ受体Ⅲ类B(FcγRⅢB)基因缺失患者11例(包括1例供者)。

1.3 抗体标记及流式细胞仪获取按照陆道培医院流式细胞室常规操作[1]。粒细胞发育阶段的观察使用CD16/CD13/CD45/CD11b抗体组合，单核细胞的评价使用CD14/CD64/CD45/CD11c组合。髓系原始细胞性质判断使用CD34和(或)CD117设门，观察CD7、CD56、CD19、HLA-DR、CD33、CD13、CD11b、CD15、CD96等标志是否存在异常表达。使用FLAER/CD64/CD45/CD14抗体组合以及红细胞和粒细胞的CD55、CD59评价PNH克隆。

2 结果

50例正常对照，发育阶段粒细胞CD16/CD13表达相似，均呈现“对勾”形状。其他免疫表型有：髓系原始细胞无异常表达，红细胞和粒细胞CD55、CD59，粒细胞和单核细胞CD55、CD59、FLAER均无明显丢失。

50例MDS患者粒细胞CD16/CD13表达模式异常。主要表现为：CD16的表达多呈现不同程度的延续性；因为CD13和CD16抗原表达强度改变或者分布异常导致的粒细胞CD16/CD13发育模式异常。其他伴随免疫表型有：常同时伴有粒细胞颗粒性减低、粒细胞CD11b/CD13发育模式异常等改变；髓系原始细胞可能会出现异常表达；原始细胞中CD19+B祖细胞占比减低；单核细胞异常表达；有核红细胞比例升高、细胞变大、异常表达等。

62例PNH患者粒细胞CD16/CD13表达模式与正常对照不同，非常有特征性：CD16不同程度部分丢失；阴性和阳性细胞之间有明显界限；阴性部分不是CD16完全丢失，而是呈现弱阳性。其他伴随免疫表型有：同时出现粒细胞CD24、单核细胞CD14等GPI相关蛋白的丢失；红细胞CD55、CD59，粒细胞和单核细胞CD55、CD59、FLAER的阴性细胞比例升高。

与其他粒细胞相关疾病不同，11例疑诊为FcγRⅢB基因缺失患者粒细胞CD16完全丢失(见图1)。除此之外无异常表达，CD55、CD59、FLAER表达无缺失。

3 讨论

CD16抗原是人类FcγⅢ类受体(FcγRⅢ)，由位于1q22染色体上的FcγRⅢA和FcγRⅢB两个基因编码。前者主要表达于NK细胞和巨噬细胞，后者是一个糖基化磷脂酰肌醇(GPI)膜锚蛋白，只表达于粒细胞。所以FcγRⅢB基因缺失的患者、由于GPI蛋白缺陷导致的PNH病例，粒细胞CD16表达发生改变，而NK细胞的CD16表达不受影响[2]。

CD16的抗体复杂，文献报道不同克隆的抗体针对不同位点：泛-FcγRⅢ CD16单克隆抗体主要包括：CLBFcRgranl (mIgG2a)、3G8 (mIgGl)、DJ13Oc (mIgGl)、BW209i2 (mIgG2a)；其他大多数克隆只针对部分位点，所以根据研究目的使用不同克隆抗体。临床免疫分型检测因为需要诊断和鉴别诊断各种疾病或者多态性，所以建议使用泛-FcγRⅢ CD16单克隆抗体。本文中使用的是3G8抗体。CD13荧光强度随着粒细胞分化成熟发生改变，所以临床常用CD16/CD13表达模式观察粒细胞发育情况。

图1 使用骨髓粒细胞CD16/CD13表达模式鉴别粒细胞相关疾病。显示细胞群为发育阶段粒细胞。a.健康对照。粒细胞CD16/CD13呈现对勾形状。b.MDS病例。粒细胞CD16/CD13发育模式异常，CD16表达为延续性的分布异常。c.PNH病例。粒细胞CD16部分丢失，阴性和阳性之间有明显界限，阴性部分呈现弱阳性表达。D.疑诊FcγRⅢB基因缺失病例。粒细胞CD16完全丢失。

粒细胞CD16和CD16/CD13表达异常主要见于几种情况：MDS[3]或者MDS/MPN、PNH[4]、FcγRⅢ B基因缺失[2]，此外有些感染、营养性贫血也可以出现粒细胞的CD16/CD13异常。但是只有FcγRⅢ B基因缺失是CD16完全丢失，其他疾病多少都会残留一些CD16的表达。

MDS或者MDS/MPN的粒细胞CD16表达为延续性分布异常，导致CD16/CD13发育模式异常，同时伴有CD11b/CD13的发育模式异常。此外还会伴有粒细胞的其他异常表现，髓系原始细胞的异常、红细胞和巨核异常、单核细胞异常、原始细胞中B祖细胞占比减低等，文献[3]报道流式细胞术免疫分型诊断MDS的灵敏度为69%-98%，特异性78%-93%。结合临床病史、骨髓形态学、染色体、基因突变等检查会提供更多诊断信息。MDS是临床上出现血细胞减少时首要想到的诊断之一，因此在经验不足的情况下，出现粒细胞CD16/CD13表达模式异常时，也是容易误诊为该疾病。

PNH[4]克隆大小差别很大，因此粒细胞CD16/CD13的表达模式也会有不同。文章中的62例患者，CD16/CD13能看到的克隆大小1%-99%(中位数75%)。外周血因为均为表达CD16的成熟阶段粒细胞，因此观察灵敏度较高。骨髓因为存在CD16阴性的早幼粒和中晚幼粒阶段细胞，所以少量的缺失容易被掩盖，尤其是与MDS同时发生的时候。PNH的CD16丢失非常有特征性：不像MDS的延续性分布异常，而是阴性和阳性之间有明显界限；阴性部分呈现弱表达，而非FcγRⅢB基因缺失那样的完全阴性。有研究认为，CD16细胞表面FcγRⅢB比GPI分子大，可能存在GPI以外的结合位点和信号通道，导致PNH的CD16阴性部分呈现背景升高，非完全阴性。

与MDS、PNH相比，FcγRⅢB基因缺失发病率相对较高，但是因为绝大多数没有明显临床表现，很多见于正常人，加上是除了流式细胞术以外，大多数其他检测方法(尤其是第一道筛查项目形态学)无法发现的疾病，因此非常容易被临床忽略。文献报道粒细胞相关FcγRⅢB基因缺失在白人中发生率为0.1%，此外还有3%左右是杂合子[2]。在中国人中发病率尚无报道。因至少一系减少或者健康供者来陆道培医院做免疫分型的患者中，排除其他影响因素后疑诊为FcγRⅢB基因缺失的患者检出率为0.2%。但是除了少数供者以外未包括大多数健康人，故数据统计缺乏人群代表性；而且研究只是排除其他疾病后推测，并未做相关基因检测，所以可能造成推测的阳性率高于文献报道[2]。但是也说明粒细胞相关的FcγRⅢB基因缺失或者说多态性的发生率可能并不低。虽然研究发现，FcγRⅢB基因缺失患者因为存在FcγRⅢA，所以大多数人并没有严重感染，且最初是在健康献血员和供者中发现[2]，故认为是一种可以忽略的正常人群多态性，但是在临床诊断中，因为CD16的表达缺失会造成CD16/CD13表达模式异于正常，经验不足的情况下容易误诊为MDS等其他粒细胞相关疾病，所以流式检测医师应该正确认识这种疾病。

总之，使用流式细胞术检测髓系CD16/CD13表达，不同粒细胞相关疾病会呈现各自特征性表达模式。其中FcγRⅢB基因缺失虽然发病率高但却是临床容易忽略的问题，PNH也会造成CD16/CD13表达异常，经验不足的时候这些疾病均容易误诊为MDS。而正确认识流式细胞术检测粒细胞CD16/CD13免疫表型，可以简单有效鉴别这些相关疾病。