非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织与脂质代谢相关基因FAS、ACC和SREBP-1水平分析*

张 猛，陈 晹，刘 娇，李叶晟，黄杨卿

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD) 是脂肪肝分类中的一种，主要是指在非酒精因素作用下所引起的肝脏实质细胞脂肪变性和脂肪沉积病症，是代谢综合征在肝脏的具体表现，主要的病理改变是肝细胞内因代谢障碍而异常堆积的甘油三酯(triglycerides，TG)和异常沉积的总胆固醇(total cholesterol，TCH)。近年来，由于饮食结构和生活习惯等的变化，NAFLD在我国呈逐年上升趋势，已经逐渐成为发病率第一位的肝脏疾病[1-3]。NAFLD的发生发展是个体、环境和遗传等多种因素共同作用的结果，涉及到多基因、多环节和多途径，具体的发病机制较为复杂，至今尚未完全明确。在这些因素中，肝脏的脂质代谢异常被认为是最关键的环节之一。胆固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs) 是一类位于内质网上的膜连接蛋白。在肝脏， SREBPs 有3种同型异构体，而SREBP-1在3种同型异构体中含量最高，甘油三酯(TG)的合成和代谢受SREBP-1的转录调控[4]。SREBP-1与固醇反应元件 (sterol response element，SRE) 结合后激活下游与脂质合成有关的关键酶，如 FAS、ACC1、HMGCoA还原酶等，其中乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme carboxylase, ACC)催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A，合成长链脂肪酸前体，脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)则是催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A、参与长链脂肪酸生成的内源性蛋白酶[5]。 本实验旨在通过建立非酒精性脂肪性肝病小鼠动物模型，分析其肝组织脂质代谢相关基因SREBP-1、FAS和ACC水平变化，以探讨非酒精性脂肪性肝病与脂质代谢相关基因异常表达之间的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 SPF级雄性C57BL/6J小鼠20只，4 周龄，购自安徽医科大学实验动物中心，饲养于安徽医科大学实验动物中心，适应性喂养1周，保证小鼠能够自由饮食，维持12 h昼夜交替光照，饲养温度控制在(25±2)℃，湿度保持在(50±5)%。检测总胆固醇试剂盒和甘油三酯试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)；多聚甲醛(上海化学试剂有限公司，中国)；TRIzol 试剂(Invitrogen 公司，美国) 。基础饲料、高脂饲料和饲养用垫料均购于安徽医科大学动物实验中心。基础饲料配方主要为：碳水化合物60%，蛋白质 22%， 粗纤维5.6%，脂肪2.4%，其他 10.0%；高糖、高脂饲料组成：基础饲料 66.5%，蔗糖 10%，猪油 20%， 胆固醇 3.4%，胆酸钠 0.1%。SW-CJ-IF型超净工作台(苏州泰安空气技术有限公司，中国) ；Sigma3-16K 高速离心机(Sigma公司，美国) ；7800 型 PCR 反应扩增仪 (ABI公司，美国) ；Lejca荧光显微镜(Lejca公司，德国)；722S分光光度仪(上海紧密科学仪器公司；中国)；LKB-NOVA型超薄切片机(LKB公司，瑞典)；LightCycler 480 分析仪(罗氏公司，美国)。

1.2 NALFD模型的制备 将20只C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组和NAFLD模型组，每组10只。给予对照组小鼠基础饲料，给予NAFLD模型组小鼠高糖、高脂饲料，小鼠自由进食，定期监测小鼠体质量。在喂养24 w末，处死小鼠并解剖，收集血清。获取肝脏组织，取部分肝组织置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋后切片，HE染色，于光学显微镜下观察肝组织脂肪变性情况；其余的肝脏组织置于液氮中，用于提取总RNA。

1.3 检测 用TRI reagent试剂盒，提取肝组织总RNA，加入DNA 酶活化，提取总RNA 2 μg，采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法进行逆转录反应。采用primer design 软件设计引物, 由上海生物工程公司合成。内参：18 S上游：5’GTAACCCGTTGAACCCCATT 3’，18 S下游：5’ CCATCCAATCGGTAGTAGCG 3’，扩增片段长度为151 bp；FAS上游：5’CGCTCGGCTCGATGGCTCAG3’，FAS下游：5’CCAGCACCACGGCATGCTCA3’，扩增片段长度为157 bp；SREBP-1上游： 5’ GTGAGGCGGCTCTGGAACAGA

C3’，SREBP-1下游：5’ ATAGGGGGCGTCAAACAGGCC3’，扩增片段长度为134 bp。ACC上游： 5’CCGTTGGCCAAAACTCTGGAGCTAA 3’，ACC下游：5’GAGCTGACGGAGGCTGGTGACA3’，扩增片段长度为149 bp。 使用LightCycler 480 分析仪进行cDNA 扩增反应，95 ℃预变性5 min ，依次行95 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s 和72 ℃延伸30 s，设定循环50 次。选择18 S 作为内参对照，各基因mRNA 水平以其与对照比值表示。

2 结果

2.1 两组小鼠肝质量的比较 在喂养24 w末，对照组小鼠肝质量为(1.1±0.2)g，NAFLD组小鼠肝质量为(1.6±0.3)g，两组小鼠肝质量差异有统计学意义(t=4.385,P<0.001)。

2.2 两组肝组织病理学变化比较 对照组小鼠肝脏组织结构完整，细胞呈放射状整齐排列，细胞核圆，位于中央，细胞胞质丰富，核膜清晰，肝细胞无脂肪浸润；在NAFLD模型组，肝细胞排列不整齐，肝细胞内出现大小不等的脂滴，细胞胞质呈现空泡状，细胞核偏移(图1)。

图1 两组小鼠肝组织病理学变化(HE，100×)

2.3 两组小鼠血清TG和TCH水平比较 在实验24 w末，对照组小鼠血TG水平为(0.28±0.06)mmol/L，TCH水平为(2.78±0.6)mmol/L，而NAFLD组小鼠血TG水平为(0.63±0.13)mmol/L，TCH水平为(7.23±0.7)mmol/L(TG: t=7.731,P<0.001；TCH: t=15.263,P<0.001)，差异显著(图2)。

图2 两组小鼠血清TG和TCH水平比较

2.4 两组小鼠肝组织FAS 、SREBP-1和ACC mRNA水平比较 在实验24 w末，NAFLD组小鼠肝组织FAS 和SREBP-1 mRNA水平分别为(3.9±1.1)和(1.8±0.7)，对照组则分别为【(1.0±0.3)和(1.0±0.4)，FAS:t= 6.231,P<0.001； SREBP-1:t= 2.431,P=0.035】，差异显著(图3)；NAFLD组小鼠肝组织ACC mRNA水平为(1.2±0.5)，与对照组【(1.0±0.4)，t= 0.765,P=0.462，图3】比，无显著差异。

图3 两组小鼠肝组织FAS 、SREBP-1和ACC mRNA水平比较

3 讨论

流行病学研究表明，NAFLD已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，发病率为20%～30%，而在肥胖人群中，其发病率更高。目前认为, NAFLD 主要有三个阶段, 即单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)和肝纤维化阶段。更进一步地，可能会进展为肝硬化甚至是肝细胞癌[6-7]。目前，NAFLD的发病机制尚未完全清楚。因此，很多关于其发生机制的研究都基于动物实验。常用的NAFLD的动物模型有营养失调性模型、药物中毒模型、基因改良模型和复合性模型等[8]。本研究采用高脂饲料喂养小鼠建立NAFLD模型，该模型的优点是可形成肥胖、代谢综合征等表现的与人类NAFLD发病机制最相似的经典非酒精性脂肪性肝病，镜下可见大细胞性脂肪变性、肝小叶炎症、纤维化等病理改变[8，9]。在本研究中，经高脂饲料喂养24周后，小鼠肝组织肝细胞排列不整齐，肝细胞内出现大小不等的脂滴，细胞胞质呈现空泡状，细胞核不居中，出现NAFLD样的病理改变。本研究中，与对照组相比，NAFLD小鼠血清TG和TCH水平显著上升，与文献报道一致[10，11]。

SREBP是位于内质网上的膜结合的转录因子，可通过调节下游一系列靶基因来参与脂质自稳态的多个方面调节，被认为是调节细胞脂质自稳态的“枢纽”。目前，已经在肝脏组织中发现有3 种SREBP：即SREBP-1( 包括SREBP -1a 和SREBP -1c)和SREBP -2。SREBP -1c构成了体内90%的SREBP-1，而TG的合成和代谢受SREBP -2的转录和调控，SREBP -2可特异性激活胆固醇代谢基因[12]。SREBP-1c 前体蛋白在内质网合成后与SREBP 裂解激活蛋白(SCAP)结合，并由其送到高尔基体，分别被位点1、位点2 蛋白酶依次加工，释放氨基末端片段入核，与其靶基因启动子的固醇调节元件或E盒结合，即为nSREBP-1c，此活性形式能够调控与TG 合成相关的靶基因， 如ACC1、FAS、SCD1 等30 多个基因的转录过程，因此SREBP-1c被称为“脂毒性的门卫”[13]。机体通过SREBP精细调节着脂质合成。当SREBP 过度表达时则可引起器官和循环系统中TG和TCH的增高，从而导致器官和外周的脂质蓄积[14，15]。肝细胞中的胆固醇和脂肪酸合成是偶联的，并且通过胆固醇生物合成途径的通量是最大SREBP-1c表达和脂肪酸合成的高速率所必需的[16]。FAS是一种多功能复合酶，在合成脂肪酸方面发挥着关键的作用，与体内的脂质代谢密切相关[17]。FAS在小鼠肝脏组织中大量表达，特别是在肝细胞的细胞质中。它的表达上升是对内源性脂肪酸合成和细胞增殖的适应。随着脂类物质摄入的增加，FAS的表达往往上调，FAS基因转录增加，导致其活性增强，并引起脂肪酸合成增多和增加，在肝细胞中异常沉积形成脂肪肝[18]。有研究表明，NAFLD大鼠肝脏的FAS水平显著上调[19]。SREBP-1c、FAS和ACC是调节肝脏脂肪生成的关键基因。文献[20]报道，沉默SREBP-1c的表达可降低脂肪肝的发生率，同时抑制FAS和ACC的表达。本研究发现，NAFLD小鼠肝脏组织FAS 和SREBP-1 mRNA水平均显著上调，而NAFLD小鼠肝脏组织ACC水平与对照组小鼠无显著差别。在未来，仍需要更进一步研究来探索在NAFLD发生发展过程中，肝脏脂质代谢相关基因所扮演的角色。

本研究采取高脂饲料喂养建立NAFLD小鼠模型，发现NAFLD小鼠肝脏组织FAS 和SREBP-1 mRNA水平均显著上调，提示NAFLD小鼠肝脏脂质代谢紊乱，为进一步研究NAFLD的发生发展机制奠定了基础。