非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织Vaspin表达及其意义探讨*

姜佳丽，李 莉，赵 菲，钟乐萍，郭子皓，张 川，展玉涛

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是除外酒精及其他损肝因素所致的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主要特征的临床病理综合征，主要包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎以及相关的肝硬化和肝癌[1-4]。据统计，全球NAFLD平均患病率为25.4%，我国NAFLD患病率也高达20.1%[5-8]。单纯性脂肪肝为良性病变，进展缓慢，但大约20%脂肪性肝炎在10年内可进展为肝硬化，甚至部分NAFLD患者可进展为肝细胞癌。NAFLD已经成为重要的公共卫生问题。因此，加强NAFLD的防治研究非常重要。研究发现，NFALD发病与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关，但确切发病机制仍不明确[1]。近年研究发现，多种脂肪因子在NAFLD发病过程中起重要作用[2-5]。内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂(visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor，Vaspin)是新近从肥胖大鼠内脏脂肪组织分离的一种脂肪因子，是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员，主要表达于内脏和皮下脂肪组织，但其在NAFLD个体肝组织的表达状况尚不清楚[6,7]。本研究采用免疫组织化学法和Western blot法检测了NAFLD大鼠肝组织和体外培养的脂肪变性肝细胞Vaspin蛋白表达情况，以期发现Vaspin在NAFLD发病中的作用，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物、细胞与试剂 12只SPF级Sprague-Dawley(SD)健康雄性大鼠，3月龄，体质量150～180 g，购自解放军军事医学科学院实验动物中心【许可证号：XCXK-(军)2007-0040】，饲养于首都医科大学实验动物中心。分笼喂养，自由摄食饮水，每日明暗时间均为12 h，室温23～26℃，湿度为50%左右，饲养环境清洁，通风良好。HepG2细胞购自深圳市百恩微生物科技有限公司，高脂饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司，抗Vaspin抗体购自上海莼试生物技术有限公司(批号CS4593)。

1.2 脂肪肝模型的制备 采用随机数字表法随机将12只SD大鼠分为模型组6只和对照组6只。给予模型组动物高脂饮食(Lieber-DeCarli 液体高脂饮食，能量分配：70%脂肪，11%碳水化合物，18%蛋白质)，饲养7 w；在对照组，给予标准饮食(能量分配：35%脂肪，47%碳水化合物，18%蛋白质)饲养7 w。在实验结束时，处死实验大鼠，取肝组织，用10%甲醛缓冲液固定，然后进行脱水、石蜡包埋、切片、常规HE染色，显微镜下观察。采用常规免疫组织化学法，抗体浓度为1:50，以正常肝组织作为阴性对照，以脂肪组织作为阳性对照，染色，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。结果判定：细胞质或细胞膜染色呈棕黄色为阳性。

1.3 脂肪变性肝细胞模型的建立 取HepG2细胞，以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37℃，5%CO2的细胞培养箱。待细胞达到70%～80%融合时，消化传代，24 h后换液。实验分为正常组和脂肪变性组。在正常组，按上述方法培养换液，在脂肪变性组，在换液时换成终浓度为100 μM油酸(OA)的完全培养基，诱导72 h，收集细胞。

1.4 脂肪变性细胞Vaspin表达检测 采用Western blot法，收集体外培养的细胞，加入适量的细胞裂解液和等量的2×Sample buffer，混和，100℃沸水煮10 min，行SDS-PAGE电泳。切下含目的条带的SDS变性胶，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，进行电转移。随后，在含有5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中封闭60 min。加一抗(1:200) ，4℃孵育过夜，再用TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。然后，与耦联HRP的二抗(1:1000)室温孵育1 h，最后用TBST洗膜3次后，加入底物化学发光试剂，于暗室内进行X光片曝光、显影。

2 结果

2.1 肝组织病理学改变 对照组大鼠肝组织小叶结构正常，无细胞变性坏死，肝细胞索排列规整；模型组大鼠肝组织肝细胞肿胀，细胞质内可见较多的脂滴(图1)。

图1 两组大鼠肝组织学表现 (HE，400×)

2.2 两组肝组织Vaspin表达情况比较 在模型组，可见肝细胞脂滴表面Vaspin表达增强，主要表达于脂滴周围，呈深棕色，而对照组则呈阴性(图2)。

图2 肝组织Vaspin表达情况 (Sp，400×)

2.3 两组HepG2细胞Vaspin蛋白表达情况 在体外培养的肝细胞，结果显示脂肪变性肝细胞和对照组细胞Vaspin/GAPDH表达分别为(0.49±0.70)和(0.68±0.40)，差异具有显著性 (P<0.05，图3)。

图3 两组细胞Vaspin表达情况

3 讨论

近年来，随着人们生活水平的提高以及肥胖和糖尿病人口的不断增加，NAFLD的发病率逐年升高，NAFLD已成为当今世界最常见的慢性肝病[9]。尽管NAFLD的详细发病机制目前尚不明确，占主导地位的是二次打击学说，即第一次打击为代谢异常引起的胰岛素抵抗，脂质代谢异常引起脂肪在肝细胞内过多聚集，从而导致肝细胞脂肪变性，形成单纯性脂肪肝。第二次打击为在第一次打击的基础上，出现氧化应激、细胞凋亡、脂肪因子和炎症因子分泌，促进脂质过氧化物的产生。第二次打击可导致肝细胞损伤和凋亡，引起肝脏炎症的发生，形成脂肪性肝炎。肝脏炎症进一步激活肝脏星状细胞，产生大量的细胞外基质，逐渐形成肝纤维化和肝硬化[10-12]。在此学说中，脂肪因子在脂肪性肝炎发生过程中起重要作用。已经证实，脂肪组织是一个活跃的内分泌器官，能分泌多种具有生物活性的脂肪因子，包括瘦素、脂联素、内脂素和Vaspin等，其异常表达与胰岛素抵抗或糖脂代谢有关，它们可通过多种途径使脂肪组织释放更多的游离脂肪酸，增多的游离脂肪酸被肝脏摄取，导致NAFLD的发生[14]。

Vaspin是由Hida et al近年从OLETF大鼠(一种2型糖尿病模型动物，具有腹型肥胖、胰岛素抵抗、高血压、高血脂等特征)的内脏脂肪组织中分离得到的一种脂肪因子，具有典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂的特点，其异常表达与胰岛素抵抗有关[14,15]。研究发现，Vaspin能够增加肥胖小鼠腹部内网膜白色脂肪组织和皮下白色脂肪组织葡萄糖转运因子4和脂联素的表达，抑制瘦素、抵抗素和TNF-α的表达，推测Vaspin可能通过参与调控胰岛素抵抗相关基因表达，而胰岛素抵抗是NAFLD发病的重要因素，因此我们推测Vaspin可能与NAFLD的发病有关。关于Vaspin与脂肪肝的关系，目前存在争议，多数研究表明血清Vaspin水平增加可能与NAFLD发生有关[3，16]，但也有少数研究认为血清Vaspin与NAFLD发生无关[17]。血清Vaspin水平受多种因素的影响，不能完全反映Vaspin在NAFLD动物肝组织尤其是肝组织脂肪变性细胞中的表达情况，但是目前尚未发现关于Vaspin在脂肪肝组织中的表达研究。故本研究采用免疫组织化学法和Western blot法检测了NAFLD大鼠肝组织和体外培养的脂肪变性肝细胞Vaspin蛋白表达情况，以期发现Vaspin在NAFLD发病过程中的作用。

本研究采用Lieber-DeCarli液体高脂饮食饲养SD大鼠，成功制备NAFLD模型。NAFLD 模型的制备方法有多种，其中Lieber et al应用高脂饮食和自由取食方法建立的NAFLD 模型与临床上NAFLD 患者的情况有相似之处，而且这种方法可以复制非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大部分肝脏病理学特征。Lieber-DeCarli 液体高脂饮食中多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量均较高，分别为 42%和 41%。另外，这种高脂饮食的成分都是较易购买到的，并且模型制备的时间也相对较短。因此，本实验采用了Lieber-DeCarli 液体高脂饮食方法制备NAFLD 模型。我们应用 Lieber-DeCarli 液体高脂饮食饲养 SD 大鼠 7 周，结果发现，模型组大鼠肝脏出现了NAFLD 的病理学变化，大部分肝细胞出现了脂肪变性，肝组织有气球样变的肝细胞。因此，我们的研究结果也证实，应用Lieber-DeCarli 液体高脂饮食饲养SD 大鼠能成功制备NAFLD 动物模型。

本研究中我们采用免疫组化方法检测肝组织Vaspin表达，结果发现模型组大鼠脂肪肝组织Vaspin表达增强。人原代培养肝细胞是人类肝脏细胞的适宜模型，人类肝细胞来源的细胞系HepG2具有类似人原代肝细胞的特征，并且易于获得和培养。我们在HepG2细胞，通过体外实验直接研究脂肪变性的HepG2细胞Vaspin表达情况，结果发现体外培养的脂肪肝细胞Vaspin表达增强，从而支持Vaspin可能与NAFLD发生有关。

通过动物实验，我们还发现Vaspin主要分布于肝细胞脂滴周围。脂滴是一种亚细胞结构，由甘油三酯和胆固醇构成脂滴核心，外面附着单层磷脂分子，磷脂单层内镶嵌多种蛋白，即脂滴相关蛋白。研究发现脂滴相关蛋白种类繁多，有上百种，一般分为三类，即脂滴结构功能蛋白、脂代谢相关蛋白酶和脂滴转运蛋白。脂滴相关蛋白对脂滴的形成、代谢及其调控起重要作用[18-20]，其中PAT家族蛋白是现在研究最多的蛋白。PAT家族蛋白以脂滴表面为平台对脂滴内脂质代谢进行调节。脂肪分化蛋白是PAT家族的一员，主要表达于脂肪组织、胰腺、小肠粘膜等。研究发现脂肪分化蛋白可促进肝细胞内甘油三酯以脂滴形式储存于胞浆，高脂饮食诱发的脂肪肝小鼠脂肪分化蛋白水平明显升高，而基因敲除小鼠甘油三酯含量明显降低，具有抗脂肪肝的作用[20]。在本研究，我们发现Vaspin表达于脂滴周围，推测Vaspin可能是一种脂滴相关蛋白，它对脂滴形成及代谢可能有一定的影响。NAFLD以肝细胞内脂滴形成为主要特征。因此，我们推测Vaspin可能通过影响脂滴形成，从而参与NAFLD的发病，但其详细作用及其机制有待于进一步研究探明。