SIRT6对老年人皮肤成纤维细胞迁移能力和增殖能力的影响及机制研究

翟晓艳 裴亮 赵焕新 杨李旺 杨蓉 季新燕

1山西中医药大学解剖教研室，山西榆次 030619；2山西医科大学第二医院泌尿外科，太原 030001；3山西中医药大学生理教研室山西榆次 030619；4山西中医药大学药理教研室山西榆次 030619

随着年龄的增加，人体的器官、组织修复能力均减弱，老年人创伤愈合的速度也减慢［1］。成纤维细胞作为皮肤创伤修复的重要参与者，提高其增殖能力和迁移到创伤区的能力对于促进老年创伤愈合的意义重大［2⁃3］。沉默信息调节因子 2 同源类似物 6（silent mating type information regulation 2 homolog 6，SIRT6）作为公认的抗衰老因子，属于3 类组蛋白去乙酰化酶。我们前期研究证实，SIRT6 可以提高老年人骨髓间充质干细胞的增殖和迁移能力［4］，但是对老年人成纤维细胞的作用及机制还不清楚。本课题初步探讨SIRT6 对老年人皮肤成纤维细胞增殖和迁移能力的影响及机制。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）细胞培养基、澳洲胎牛血清（美国Gibco 公司），0.25%胰酶（上海索莱宝生物科技有限公司），CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所），兔抗人SIRT6 多克隆抗体、鼠抗人β 肌动蛋白（ACTB）单克隆抗体和鼠抗人p65 及磷酸化p65（p⁃p65）多克隆抗体（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG 抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），高灵敏度化学发光检测试剂盒（上海汉恒生物科技有限公司），Trizol试剂、反转录试剂盒（美国赛默飞世尔科技有限公司），SYBR Green 荧光定量试剂盒（北京天根生物科技有限公司），倒置相差显微镜（德国莱卡公司），DUB00型核酸蛋白分析仪（美国Beckman Coulter 公司），荧光定量PCR 仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）。

二、细胞培养

取山西医科大学第二附属医院泌尿外科16 例健康男性包皮环切术切除的包皮皮肤组织，分离成纤维细胞［本研究已通过山西中医药大学医学伦理委员会审查（批件号2019LL215），受试者均签署知情同意书］。其中，青年组8例，年龄16 ～ 25（22.73±4.28）岁；老年组 8 例，年龄 50 ～ 70（57.36 ± 7.22）岁。剪去皮下组织，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，剪碎组织，加入PBS 离心，将细胞和组织碎片培养于含20%胎牛血清的IMDM 培养液中（含0.25%胶原蛋白酶Ⅱ），置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中消化、培养6 h。细胞贴壁后换为含20%胎牛血清的IMDM 培养液，待细胞80%融合后，0.25%胰酶消化，按1∶3 比例传代。实验中所用的细胞均为第4 代细胞。

三、SIRT6基因转染

委托广州赛业生物科技有限公司构建携带SIRT6 的慢病毒载体并合成病毒，将老年组皮肤成纤维细胞分成两组，一组用SIRT6-慢病毒感染使其SIRT6 表达增高作为SIRT6 组，另一组以空病毒感染作为对照组。按照慢病毒感染实验手册流程在老年人皮肤成纤维细胞生长至40% ～50%融合时，以8 mg/L 海美溴铵为助染剂感染成纤维细胞，感染复数（multiplicity of infection）值为30，18 h 后换成无病毒正常培养基，培养72 h后倒置荧光显微镜下观察感染效率，提取总蛋白，Western 印迹法检测SIRT6表达量，确定过表达SIRT6成功。

四、细胞划痕实验

将不同年龄组人皮肤成纤维细胞和感染后72 h的老年人皮肤成纤维细胞以2.5 × 105/ml 接种于6 孔板（每孔2 ml）中过夜贴壁，用20 μl移液枪枪头在孔的中央垂直做“十”字划痕，用PBS 冲洗3 次，洗去划痕处掉落的细胞，换为无血清IMDM 培养基，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养。分别在划痕后即刻和24 h 拍照，用Image J 软件测量划痕处面积，计算迁移率。迁移率=（划痕面积0h- 划痕面积24h）/划痕面积0h× 100%。

五、CCK8法检测细胞增殖活性

将不同年龄组人皮肤成纤维细胞和感染后72 h的老年人皮肤成纤维细胞接种于96孔板中（7 000个细胞/孔），加入含20%胎牛血清的IMDM 培养基中培养过夜贴壁，分别在细胞贴壁后0、12、24、48 h加入CCK8 试剂，37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育2 h后，用酶标仪测450 nm 波长处吸光度（A值）。每个时间点设3 个复孔，取均值代表细胞活性。根据细胞增殖活性绘制生长曲线。

六、Western 印迹法检测人皮肤成纤维细胞p⁃p65表达

使用 RIPA（radio immunoprecipitatipon assay）蛋白裂解液提取不同年龄组人皮肤成纤维细胞和感染后72 h的老年人皮肤成纤维细胞总蛋白，用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。取30 μl 蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至聚偏二氟乙烯膜上，加5%脱脂牛奶封闭1.5 h 后，分别加入一抗兔抗人SIRT6 抗体（1∶1 000）、鼠抗人 p⁃p65 抗体（1∶500）、鼠抗人p⁃p65 抗体（1∶500）、鼠抗人 ACTB 抗体（1∶1 000），4 ℃过夜，TBST 洗 3次，加入1∶2 000 辣根过氧化物酶标记的二抗，室温避光孵育1 h，然后加入显影液用图像分析系统采图，用Image J 软件以ACTB为内参照分析相对灰度值，蛋白相对表达水平=目标蛋白灰度值/ACTB灰度值。

七、实时定量PCR检测Col1、Col3、Itgβ1、Itgα 3、Itgα5 mRNA水平

用Trizol 试剂提取老年人SIRT6 组和对照组皮肤成纤维细胞总RNA，依据反转录试剂盒说明书反转录成cDNA。然后用SYBR Green 荧光定量法以ACTB为内参进行实时定量PCR反应。ACTB正向引物5′⁃GATGTCGCACGGTACCTG⁃3′，反向引物5′⁃TCTCTGGTTCTTTCAATCGGG⁃3′；Col1 正向引物 5′⁃GAGGGCAACAGCAGGTTCACTTA⁃3′，反向引物 5′⁃TCACCACCACCGATGTCCA⁃3′；Col3 正向引物 5′⁃CCACGGAAACACTGGTGGAC⁃3′，反向引物 5′⁃GCCAGCTGCACATCAAGGAC⁃3′；Itgβ1 正向引物5′⁃TTGTGAAGCCAGCAACGGACAG⁃3′，反向引物 5′⁃CAAGGCAGGTCTGACACATCTCAC⁃3′；Itgα3 正向引物 5′⁃ACCTCCTCCTCCTCCTCTTCCTC⁃3′，反向引物5′⁃AGGCACAGGCTCTGGAGAACC⁃3′；Itgα5 正向引物5′⁃CGCCATCAGCACTGTGTCCAC⁃3′，反向引物 5′⁃AGCTGTGCAATGGACCAAGGC⁃3′。 反 应条 件 ：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环 ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以2-△△Ct表示目的基因mRNA相对表达量。

八、统计学方法

使用GraphPadPrism 5 软件进行统计分析。实验数据均为计量资料，以表示，两组资料比较采用t⁃test检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、不同年龄组人皮肤成纤维细胞的形态

见图1。倒置显微镜下，不同年龄组原代人成纤维细胞的形态没有显著差异，有散在细胞，也有围绕在组织块周围呈放射状排列的细胞，大部分为圆形或者梭形，细胞较小。第4 代时，细胞逐渐变大，梭形细胞逐渐扁平发出突起，其中老年组细胞突起更多。

二、皮肤成纤维细胞中SIRT6、p⁃p65表达

老年组人皮肤成纤维细胞中SIRT6 蛋白表达水平较青年组显著下降（P＜ 0.05），但p⁃p65表达显著升高（P＜ 0.05）。见图2、表1。

三、皮肤成纤维细胞的迁移能力和增殖能力

图1 不同年龄组人皮肤成纤维细胞传代不同次数后细胞形态 黄色箭头示散在细胞，红色箭头示放射状排列的细胞。第4 代成纤维细胞较原代细胞增大，且逐渐扁平发出突起，老年组细胞突起更明显

划痕实验显示，青年组人皮肤成纤维细胞24 h细胞迁移率为（94.63% ± 12.32%），老年组为43.81% ± 18.84%，两组差异有统计学意义（t=5.903，P=0.003）。见图3。

CCK8 实验显示，12 h 时老年组与青年组人皮肤成纤维细胞活力均有增加，两组间差异无统计学意义（t=0.991，P=0.512）；老年组24 h（t=4.043，P=0.007）和48 h（t=5.336，P=0.004）时的增殖活性明显低于青年组，差异均有统计学意义。见图4。

图2 Western 印迹检测不同年龄组人皮肤成纤维细胞中沉默信息调节因子2同源类似物6（SIRT6）和p⁃p65蛋白表达水平

表1 不同年龄组人皮肤成纤维细胞中沉默信息调节因子2同源类似物6（SIRT6）和p⁃p65蛋白表达水平比较（）

表1 不同年龄组人皮肤成纤维细胞中沉默信息调节因子2同源类似物6（SIRT6）和p⁃p65蛋白表达水平比较（）

例数8 8组别青年组老年组t值P值SIRT6 1.000±0.067 0.434±0.179 3.040 0.012 p⁃p65 1.000±0.093 1.694±1.148 2.949 0.015 p65 4.316±0.303 4.732±0.475 0.863 0.408

图3 划痕实验检测不同年龄组人皮肤成纤维细胞的迁移能力 24 h时青年组人成纤维细胞较老年组划痕宽度明显降低

图4 不同年龄组人皮肤成纤维细胞生长曲线 青年组和老年组人皮肤成纤维细胞增殖活性在12 h时没有差异，24 h和48 h时差异均有统计学意义。a：P ＜0.01

四、SIRT6 过表达对老年组皮肤成纤维细胞迁移能力和增殖能力及Col 1、Col 3、Itgα1、Itgα3和Itgβ1 mRNA表达水平的影响

细胞感染后72 h 可见老年人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白阳性（图5），且SIRT6 组细胞SIRT6蛋白表达水平显著高于对照组，t=3.040，P＜0.01，见图6、表2。

划痕实验显示，SIRT6 组老年人成纤维细胞24 h 迁 移 率 为 68.30% ± 10.347% ，较 对 照 组39.48% ± 3.234%显著改善，差异有统计学意义（t= 5.404，P＜ 0.05）（图 7）。CCK8 实验显示，SIRT6 组老年人成纤维细胞24 h 和48 h 增殖速度较对照组提高明显（均P＜0.05）（图8）。实时PCR显示，SIRT6 组成纤维细胞Col 3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA 表达水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05），见表2。

五、SIRT6过表达对老年人成纤维细胞p⁃p65表达的影响

细胞感染后72 h Western 印迹检测结果显示，SIRT6 组老年人皮肤成纤维细胞p⁃p65 蛋白水平低于对照组（P＜ 0.05）。见图6、表2。

讨论

图5 老年人皮肤成纤维细胞感染72 h 后倒置荧光显微镜观察 对照组（感染空病毒）和SIRT6 组（感染SIRT6 慢病毒）老年人皮肤成纤维细胞中均可见绿色荧光蛋白表达

图6 Western 印迹检测老年人皮肤成纤维细胞感染SIRT6 慢病毒后p⁃p65蛋白水平的改变

图7 划痕实验检测细胞感染后老年人成纤维细胞迁移能力的改变 划痕24 h后，感染SIRT6慢病毒组老年人皮肤成纤维细胞较感染空病毒组划痕宽度显著下降

图8 感染慢病毒后老年人皮肤成纤维细胞增殖活性的变化细胞感染SIRT6 慢病毒后24 h 和48 h，增殖活性显著高于对照组。a：P ＜ 0.05

创面愈合分为炎症、再上皮化和组织重塑3 个主要阶段，在创面愈合中关键因素是修复细胞的增殖和迁移能力。成纤维细胞作为皮肤创面愈合中组织重塑的核心细胞，起到至关重要的作用［1⁃2］。SIRT6 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadenine dinucleotide）依赖的组蛋白去乙酰化酶，被证实可以抑制细胞衰老，并可以延长小鼠寿命［5⁃7］。本研究显示，随着年龄增长，人皮肤成纤维细胞形态学没有发生显著变化，但是SIRT6的表达降低，这与既往报道中SIRT6 在人成纤维细胞的表达随年龄增加而降低的结果一致［7⁃8］。同时本研究还显示，老年人皮肤成纤维细胞的增殖能力和迁移能力也有所降低。

为了探讨SIRT6 的表达水平与成纤维细胞的增殖能力和迁移能力之间的关系，本实验感染SIRT6 基因至老年人成纤维细胞，使其SIRT6 表达增高，观察其对细胞增殖能力和迁移能力的影响。结果证实，SIRT6 表达增高后，老年人成纤维细胞的增殖能力和迁移能力均明显改善，提示SIRT6 可能对创伤愈合中的组织重塑起促进作用，是改善皮肤创伤愈合的一个重要靶点。

表2 感染SIRT6慢病毒后老年人皮肤成纤维细胞中Col1、Col3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA以及SIRT6等蛋白表达变化（）

表2 感染SIRT6慢病毒后老年人皮肤成纤维细胞中Col1、Col3、Itgβ1、Itgα3、Itgα5 mRNA以及SIRT6等蛋白表达变化（）

注：n=4。SIRT6：沉默信息调节因子2 同源类似物6；Col1：Ⅰ型胶原蛋白；Col3：Ⅲ型胶原蛋白；Itgβ1、Itgα3、Itgα5：整合素亚基β1、α3、α5。对照组：感染空病毒；SIRT6组：感染SIRT6慢病毒

组别对照组SIRT6组t值P值Col 1 mRNA 1.0±0.133 1.3±0.092 0.976 0.352 Col 3 mRNA 1.0±0.362 2.2±0.214 5.692 0.015 Itgβ1 mRNA 1.0±0.140 1.7±0.119 4.478 0.043 Itgα3 mRNA 1.0±0.427 3.1±1.372 5.321 0.033 Itgα5 mRNA 1.0±0.261 1.9±0.063 5.773 0.015 SIRT6 1.000±0.178 2.730±0.067 3.040 0.002 p⁃p65 1.000±0.062 0.634±0.179 2.949 0.015 p65 4.621±0.285 4.884±0.582 0.863 0.408

创伤愈合是一个复杂的过程，多种因素参与其中，包括周围其他细胞、细胞因子、胶原蛋白等，SIRT6 如何影响成纤维细胞增殖和迁移能力，目前还不清楚。我们进一步检测成纤维细胞分泌的胶原蛋白、迁移能力相关的整合素等表达的变化。Col 1 主要存在于成熟组织中，Col 3 主要是新生的胶原蛋白，本研究中SIRT6 过表达后，Col 3 表达升高明显，提示SIRT6 可能促进成纤维细胞增殖使新生Col 3 增多，也可能是SIRT6 本身可以提高成纤维细胞Col 3 的分泌能力，还有待进一步研究和证实。Rippa 等［9］报道创伤发生时，成纤维细胞会上调 Itgα5β1 和 α3β1 的表达，促进细胞向创伤区域迁移。本研究中 SIRT6 过表达后Itgβ1、Itgα3、Itgα 5 mRNA 水平增高，提示SIRT6 可能通过上调整合素表达促进细胞迁移。

NF⁃κB 参与细胞的多种生物学过程，其中包括衰老过程，目前研究普遍认为，NF⁃κB 是衰老相关的分泌表型，可以促进细胞的衰老。本研究中SIRT6 过表达后，NF⁃κB 亚基 p⁃p65 表达下降，迁移能力和增殖能力升高，提示SIRT6 可能通过抑制NF⁃κB 通路，提高老年人皮肤成纤维细胞的迁移和增殖能力，达到抗衰老的目的。有研究证实，SIRT6可以通过抑制 NF⁃κB 通路，延长小鼠寿命［6］。Goyarts 等［10］也发现，SIRT6 表达下调后 NF⁃κB 表达增多。本研究结果与上述结论一致。

综上，SIRT6 可能通过抑制 NF⁃κB 通路从而促进成纤维细胞增殖和迁移，但是NF⁃κB通路如何影响细胞增殖和迁移，与下游的哪些基因和通路有关均有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突