金荞麦种子质量检验方法△

李进瞳，靳云西，林晖才，曾燕，矣健玲，焦连魁，李向东，王继永，*

1.国药种业有限公司，北京 100035；2.中国中药有限公司，北京 100035

金荞麦为蓼科荞麦属植物金荞麦Fagophyrumdibotrys(D.Don) Hara的干燥根茎，气微，味微涩；具有清热解毒、清肺排痰、排脓消肿、祛风化湿之功效，用于肺脓疡、麻疹肺炎、扁桃体周围脓肿等症[1-2]。现代药理研究表明，金荞麦在抗菌消炎、抗氧化、降血脂、抗癌、抑制肿瘤细胞侵袭和转移及增强免疫力等方面具有明显的药理活性[3-4]。金荞麦分布于我国黄河以南的多个省区，主要以云南、贵州、四川3省野生资源最为集中，其繁殖方式主要为有性繁殖和无性繁殖[5]。目前，金荞麦生产主要以无性繁殖为主，生产上存在种植后繁殖材料腐烂、易发病及种源退化减产等问题，对金荞麦的研究多数在其药理作用和化学成分等方面，有关金荞麦种子质量检验方法的研究尚未见报道。因此，本研究对金荞麦种子的千粒质量、生活力、含水量及发芽条件等进行了系统的研究，以期为金荞麦种子检验规程和质量分级标准的制定提供科学依据，为金荞麦种苗培育及规范化栽培提供保障。

1 材料

试验材料为2015年12月分别在云南昆明(Y)、重庆黔江(C)收集的金荞麦种子，并于2016年3月开展方法学试验研究。经中国中药有限公司王继永研究员鉴定为金荞麦Fagophyrumdibotrys(D.Don) Hara的种子。

赤霉素(生化试剂，国药集团化学试剂有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；聚乙二醇-6000(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。FA2004B分析天平(上海实验仪器有限公司)；D101电热鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司)；GTOP-Y智能光照培养箱(浙江托普云农科技有限公司)；AS3120型超声波清洗仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

2 方法

2.1 扦样

参考GB/T 3543.2—1995“农作物种子检验规程—扦样”执行，确定金荞麦种子批的最大质量和样品最小质量。

2.2 净度分析

按GB/T 3543.3—1995“农作物种子检验规程—净度分析”执行。将扦样得到的样品用筛选法，即用《中华人民共和国药典》1号筛(孔径10 mm)，筛除种子中的其他种子、灰尘、土块、残枝败叶、虫卵等杂质，再利用风选法，筛除未成形的种子和花序，计算种子净度，重复3次。

2.3 质量测定

将纯净的金荞麦种子用四分法分成4份，分别采用百粒法、五百粒法、千粒法测定金荞麦种子的千粒质量。1)百粒法：从混合均匀的净种子中随机取样8个重复，每重复100粒，各重复称质量，计算8个重复的平均值、标准差及变异系数。2)五百粒法：从混合均匀的净种子中随机取样4个重复，每个重复500粒，各重复称质量，计算4个重复的平均值、标准差及变异系数。3)千粒法：从混合均匀的净种子中随机取样3个重复，每个重复1000粒，各重复称质量，计算3个重复的平均值、标准差及变异系数。

2.4 真实性鉴定

采用种子外观形态鉴定方法，随机数取100粒种子，3次重复，用解剖镜和显微镜逐粒观察金荞麦种子的形态特征并进行记录。

2.5 含水量测定

取金荞麦净种子，参照GB/T 3543.6—1995“农作物种子检验规程—水分测定”中苦荞的测定方法，即分别取研磨后的种子5.0 g(50%过0.5 mm筛)，用低恒温烘干法(103±2)℃测定。设置1、2、3、4、5、6、7、8 h，每小时称定质量1次，至恒重，计算种子含水量，重复4次。

2.6 发芽率测定

2.6.1种子发芽前处理方法 1)超声波处理：采用AS3120型超声波仪，40 kHz处理60 min，于自来水中浸种；2)GA3处理：将种子在100 mg·L-1GA3溶液中浸种；3)20%PEG-6000溶液浸种；4)以自来水浸种为对照；以上4种处理的浸种时间均为24 h；处理中的每项处理150粒种子，分3次重复，每个重复50粒种子[6-10]。

2.6.2发芽床的选择 用GA3处理方法处理种子，在25 ℃下，设置沙、沙土(沙∶土=3∶1)、滤纸、褶皱纸、棉花5种不同发芽床，确定最佳发芽床；选择2份不同产地样品，每个试验设置3次重复，每个重复50粒种子。

2.6.3发芽温度和不同种子处理方法的选择 用不同的种子处理方法处理种子，分别设置发芽温度为15、20、25、30、35、40 ℃ 6个温度；置于确定的最佳发芽床上；选择2份不同产地样品，每个试验设置3个重复，每个重复50粒种子。

2.6.4培养 所有处理均依据GB/T 3543.4—1995“农作物种子检验规程—发芽试验”中苦荞的培养条件进行培养，光照12 h，光强为25 000 lx，培养16 d，统计发芽率。

2.6.5发芽计数时间的确定 根据种子发芽的情况，确定初次和末次计数时间。种子萌发以胚根突破种皮1 cm为初次计数时间，以种子萌发数达到最高且以后再无萌发种子出现时的天数为末次计数时间。

2.7 生活力测定

采用TTC法测定金荞麦种子生活力。种子经蒸馏水浸泡12 h，沿种子垂直腹缝线纵切去2/5，对照为煮死种子。分别设置1、2、3、4、5 h的5个不同染色时间；设置30、35、40、45 ℃的4个不同染色温度；设置0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%的6个不同TTC浓度，确定TTC染色法的最佳染色条件。每个处理3次重复，每个重复用100粒种子(200个半粒)，胚及子叶全部染成红色为有生活力的种子。

3 结果

3.1 扦样

采用徒手减半法扦取试验样品，种子批的最大量为2000 kg，送检样品最少量为1000 g，按GB/T 3543.3—1995规定，最小试样量应大于2500粒种子，净度分析试验量最少为100 g。

3.2 净度分析

试验样品为不同产地的2份金荞麦种子。2份样品中均不存在其他植物种子，由杂质和净种子组成，杂质为土块、残枝败叶、花萼、花瓣等。采用此方法做的净度分析，各样品重复间种子质量差距均没有偏离原始质量的5%，因此该方法和程序切实可行，见表1。

表1 不同产地金荞麦种子净度

3.3 质量测定

采用3种方法对不同产地的2份金荞麦种子的质量进行了测定。不同产地的2份种子千粒法的变异系数均>4%，其中变异系数最小的是五百粒法，由于金荞麦种子属于大粒种子，质量中等，因此，采用五百粒法测定其质量较为科学，见表2。

表2 不同产地金荞麦种子质量测定结果

3.4 真实性鉴定

金荞麦成熟种子为瘦果卵状三棱锥形，黑褐色或红棕色，大小为(6.5～7.4) mm×(4.9～5.3) mm。花被宿存。下部膨大，上部渐狭，具三棱脊，表面粗糙无光泽；显微镜下可观察到种子表面纹饰，皱纹网状，网眼圆形至方形，网脊具粗条纹[2，11]。不同主产地种子形态见图1。

图1 不同产地金荞麦种子形态

3.5 含水量测定

取2份不同产地的样品，各3个重复，在8 h内每小时测定其含水量，计算平均值的结果见图2，从图2可以看出，来自云南的样品含水量在烘6 h后为9.76%、7 h后为9.78%、8 h后为9.81%；来自重庆的样品含水量烘6 h后为9.77%、7 h后为9.74%、8 h后为9.79%；可以看出烘干6 h后，2个不同产地样品的水分含量均趋于稳定，故选定6 h为金荞麦种子含水量测定的时间。

图2 金荞麦种子不同测定时间的含水量

3.6 发芽率测定

3.6.1发芽床的确定 设置5种不同的发芽床进行金荞麦种子的发芽试验，置于滤纸床上的种子发芽率最高，明显高于其余4种发芽床，棉花床的发芽率次之，褶皱纸床发芽率最低，因此，金荞麦种子发芽的最佳发芽床为滤纸床。不同产地的2份样品在5种不同发芽床上的发芽率统计结果见表3。

表3 5种不同发芽床发芽率统计结果

3.6.2种子前处理及发芽温度的确定 用3种不同的种子前处理方法，在6个不同温度下的金荞麦种子发芽率不同，2个不同产地的金荞麦种子在温度高于40 ℃时，均不萌发，表现为种子膨大，种皮软腐，失绿，多数未见子叶，胚根萌发后干枯。3种前处理方式除超声处理外，其余2种均明显高于对照组，GA3处理组最佳；在GA3处理组中，6个不同温度下2个不同产地的金荞麦种子发芽率在20～30 ℃较高，这与苦荞种子发芽率规律一致，其中在25 ℃下金荞麦种子发芽率最佳，确定金荞麦种子发芽前处理为GA3处理，发芽温度为25 ℃，这与王宏信等[9]的研究结果一致。不同产地金荞麦种子不同前处理及不同发芽温度下种子发芽率统计结果见表4。

3.6.3发芽计数时间的确定 从胚根突破种皮1 cm开始，每24 h记录1次发芽率，共记录16 d，2个不同产地的金荞麦种子均于第2天开始萌发，发芽率分别为重庆2%、云南5%，第4～9天发芽种子数量逐渐增多，第9天后，来自于重庆的样品发芽率分别为70%(9 d)、75%(10 d)、77%(11 d)、77%(12 d)、77%(13～16 d)；来自于云南的样品发芽率分别为69%(9 d)、73%(10 d)、74%(11 d)、75%(12 d)、75%(13～16 d)。可以看出，第12天后，2个不同产地的种子均没有新的萌发。因此，确定金荞麦种子发芽计数时间为第2～12天，即第2天为初次发芽计数时间，第12天为末次发芽计数时间，见图3。

3.7 生活力测定

在不同的染色温度(30、35、40、45 ℃)条件下，以不同浓度(0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%)TTC在不同时间(1、2、3、4、5 h)进行染色，发现TTC浓度为0.5%，染色时间为 2 h，染色温度为35 ℃时的金荞麦种子染色情况最好，染色时间短，染色效果好，颜色均匀，见表5。

表4 不同温度、不同处理下金荞麦种子发芽率 统计结果

图3 金荞麦种子不同计数时间的发芽率

金荞麦种子用TTC染色法染色后的效果见图4。有活力的种子：胚和子叶全部均染色；子叶远胚根一端≤1/3不染色，其余部分完全染色；子叶侧边总面积≤1/3不染色，其余部分完全染色。无生活力种子：胚和子叶完全不染色；子叶近胚根处不染色；胚根不染色；胚和子叶染色不均匀，其上有斑点状不染色；子叶不染色面积>1/2；胚所染颜色异常，且组织软腐。

4 讨论

金荞麦药材一直依赖于野生资源的采集，其药材质量参差不齐，随着市场需求的增长和药材质量的日益高要求，越来越多的制药企业关注并进行了金荞麦的人工种植。近年来，金荞麦的种植面积和区域不断扩大，因此，建立金荞麦种子的质量检验方法，制定相应的金荞麦种子检验规程和质量分级标准，对实现金荞麦规范化种植具有重要意义。

在采收金荞麦种子的过程中，由于种子的落粒性较强，容易混有杂草的种子和土块，因此在进行净度分析时，应选用筛选法，筛除杂质和土块；另外，金荞麦花序为无限花序，在种子采收过程中，下部花序种子已经成熟，上部花序未形成种子和正在凋谢的较多，因此在进行净度分析时，筛除杂质和土块后应再进行风选，以筛除未成形的种子和凋谢的花序。

表5 在不同温度、不同TTC浓度不同染色时间 对金荞麦种子的染色效果

金荞麦种子生活力的检测方法有效可行，不同产地生活力与发芽率趋势一致，但在试验中发现同一个样品的生活力和发芽率检测值差异较大，超过了10%，这可能与金荞麦的种皮厚度和胚乳发育有关，具体原因还有待进一步研究。

图4 金荞麦种子TTC法染色效果