前胡总香豆素提取物质量标准研究

吕新林，徐国兵*，许雷鸣，洪稳稳

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230032；2.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051)

前胡为伞形科植物白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根[1]。其主要成分为吡喃香豆素类，其中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量较高。药理研究发现，该类成分不仅有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和保肝等作用，还能增进胰岛素分泌，减轻Ⅱ型糖尿病并发症对机体的损害[2-6]。国内学者对前胡香豆素类成分提取工艺已经进行了较详细研究，提取方式多采用有机溶剂浸提法和回流法，香豆素类成分提取率较低[7]。本课题组通过SFE法制备出9批前胡总香豆素提取物，进行定性定量研究，初步建立了前胡总香豆素提取物质量标准。

1 仪器和试剂

HA220-50-06超临界萃取装置(南通华安超临界萃取有限公司)；薄层色谱半自动点样器Linomat-5、薄层色谱摄像仪Repeostar3(GAMAG公司)；XS204电子天平和XS105电子天平(Mettler-Toledo公司)；Agilent 1200 和Agilent 1260(安捷伦科技有限公司)；TU-1901紫外分光光度计(上海沪粤明科学仪器有限公司)。

标准品白花前胡甲素(批号111711-201703)和白花前胡乙素(批号111904-201804)购于中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher 公司)；水为高纯水，余下试剂为分析纯。9批前胡饮片，按照2015版《中国药典》(一部)[1]前胡饮片标准进行全项检验，结果均符合规定，样品信息见表1。

表1 前胡饮片样品信息

2 方法与结果

2.1 SFE法制备前胡总香豆素

取适量前胡药材粗粉，在萃取温度60 ℃、萃取压力30 MPa、夹带剂95%乙醇比例15%和CO2体积流量20 g/min条件下萃取1.5 h[8]。提取物4 ℃静置冷藏，待结晶析出完全后移出上层脂肪油。加适量石油醚(30～60 ℃)，充分混匀后离心，弃上清，反复上述操作至石油醚(30～60 ℃)呈无色，沉淀置通风橱内挥干，即得前胡总香豆素提取物。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液

精密称取适量白花前胡甲素和白花前胡乙素标准品，加甲醇配制成每1 mL含白花前胡甲素100.24 μg和白花前胡乙素68.48 μg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液

精密称取13.36 mg前胡总香豆素提取物置于25 mL容量瓶，加甲醇适量，超声使其溶解，甲醇定容至刻度，摇匀。精密吸取2.0 mL置于5 mL容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 TLC鉴别

吸取5 μL上述对照品及各批次供试品溶液，自动点样器点于同一板上，石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂展开，置紫外光灯(366 nm)下验视。结果，在与标准品斑点对应的位置上，各供试品显现出相同颜色的荧光斑点并分离良好，见图1。

注:1、9为白花前胡甲素;2～5、7、10～13为供试品;6、14为白花前胡乙素;8为白花前胡甲素和白花前胡乙素混合标准品图1 前胡总香豆素提取物薄层鉴别

2.4 检查

2.4.1 水分

取各批次供试品2～5 g，参照水分测定法(2015版《中国药典》[1]四部通则0832第二法)测定，测得各批次前胡总香豆素提取物水分含量为0.16%～0.17%。

2.4.2 炽灼残渣

取各批次供试品1～2 g，参照炽灼残渣法(2015版《中国药典》[1]四部通则0841)进行测定，测得前胡总香豆素炽灼残渣量为0.10%～0.11%。

2.4.3 重金属

取各批次供试品1 g，参照重金属检查法(2015版《中国药典》[1]四部通则0821第二法)进行检测。结果，供试品溶液颜色均未超过标准铅溶液，各批次前胡总香豆素重金属含量均小于20 mg/kg。

2.4.4 砷盐

取各批次供试品5 g，参照2015版《中国药典》(一部)[1]连翘提取物项下砷盐检测法进行检测。结果，供试品砷斑颜色均未超过标准砷斑，各批次前胡总香豆素砷盐含量均小于2 mg/kg。

2.5 特征图谱

2.5.1 特征图谱的建立

取供试品溶液，按“2.7.1”色谱条件进样，记录色谱峰信息，结果见图2。将各批次前胡总香豆素提取物色谱峰信息导入中药色谱特征图谱相似度评价软件(2012A)，以QH-01为参照图谱，进行相似度评价。结果，该9批前胡总香豆素提取物特征图谱相似度大于0. 98，表明各批前胡总香豆素提取物之间具有良好的一致性，生成的对照特征图谱见图3。

图2 前胡总香豆素提取物的HPLC图

图3 前胡总香豆素提取物特征图谱

2.5.2 特征峰的标定

根据9批前胡总香豆素提取物特征图谱结果，共标定5个特征峰，经参比标准品色谱峰可知，峰3为白花前胡甲素，峰5为白花前胡乙素。

2.6 前胡总香豆素的含量测定

2.6.1 方法学考察

2.6.1.1 标准曲线制作

取对照品溶液，以甲醇为参比溶剂，在321 nm处测定吸光度。以进样浓度为横坐标(X)吸光度为纵坐标(Y)进行线性回归。结果，白花前胡甲素回归方程为Y=0.0195X+0.229 9(r=0.999 5)；白花前胡乙素回归方程为Y=0.018 6X+0.216 3(r=0.999 0)，表明白花前胡甲素和白花前胡乙素在一定范围内线性关系良好。

2.6.1.2 重复性、精密度和稳定性试验

取同一批前胡总香豆素提取物粉末适量，按“2.2.2”方法配制供试品溶液6份，以甲醇为参比溶剂，在321 nm处测定吸光度；取其中一份样品，在321 nm处，连续6次测定吸光度；另取一份样品分别于0、2、4、8、12、24 h在321 nm处测定吸光度并计算RSD。结果，RSD均小于2%，表明该方法重复性、仪器精密度和24 h样品稳定性良好。

2.6.1.3 加样回收率试验

精密称取前胡总香豆素提取物粉末平行6份，分别加入一定浓度的对照品溶液，按“2.2.2”方法配制供试品溶液，以甲醇为参比溶剂，在321 nm处测定吸光度并计算前胡总香豆素的加样回收率以及RSD。结果前胡总香豆素类成分加样回收率为97.21%，RSD小于2%，表明该方法的准确度良好。

2.6.2 样品测定

按“2.2.2”方法制备各批供试品溶液，以甲醇为参比溶剂，在321 nm处测定吸光度，带入“2.6.1.1”回归方程求得前胡总香豆素的含量。结果，9批样品前胡总香豆素含量分别以白花前胡甲素和白花前胡乙素计依次为78.69%～90.07%和85.62%～98.10%。

2.7 白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量测定

2.7.1 色谱条件

Inertial ODS-SPCl8色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇-乙腈-水(34∶32∶34)；检测波长321 nm；流速1.0 mL/min；柱温为室温；进样量10 μL。

2.7.2 专属性试验

分别吸取对照品和供试品溶液，在“2.7.1”色谱条件下测定色谱峰，结果见图4。由图可知，供试品HPLC图中白花前胡甲素和白花前胡乙素相应色谱峰位置上无干扰，表明该方法专属性强。

注:a.对照品溶液色谱峰;b.供试品溶液色谱峰;1.白花前胡甲素;2.白花前胡乙素图4 专属性考察HPLC图

2.7.3 线性范围

吸取“2.2.1”对照品溶液，在“2.7.1”色谱条件下测定峰面积。以进样浓度为横坐标(X)峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程以及线性范围。结果，白花前胡甲素和白花前胡乙素在一定浓度范围内线性关系良好，见表2。

表2 白花前胡甲素和白花前胡乙素的线性范围

2.7.4 重复性、精密度稳定性试验

取同一批前胡总香豆素提取物粉末适量，按“2.2.2”方法制备供试品溶液6份，在“2.7.1”色谱条件下测定峰面积；取其中一份溶液，在“2.7.1”色谱条件下连续测定峰面积6次；另取一份供试品溶液分别于0、2、4、8、12和24 h在“2.7.1”色谱条件下测定峰面积。结果，测得白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面积RSD均小于2%，表明该方法重复性、仪器精密度和24 h样品稳定性良好。

2.7.5 加样回收试验

取前胡总香豆素提取物粉末适量，平行6份，分别加入一定浓度的对照品溶液，按“2.2.2”方法配制供试品溶液，“2.7.1”色谱条件下测定峰面积，计算回收率，测得各白花前胡甲素和白花前胡乙素回收率依次为99.68%和99.66%，RSD均小于2%，表明方法准确度良好。

2.7.6 耐用性试验

2.7.6.1 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响

取同一份对照品溶液，采用Inertial ODS-SP C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，在“2.7.1”色谱条件下测定峰面积，比较Agilent 1260，Agilent 1200，Shimadzu 20A三种不同高效液相色谱系统对白花前胡甲素和白花前胡乙素相对校正因子的影响；另在 Agilent 1200高效液相色谱系统上，比较Inertial ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent (150 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent (250 mm×4.6 mm，5 μm)和CAPCELLPAK(250 mm×4.6 mm，5 μm)不同型号规格C18色谱柱对白花前胡甲素和白花前胡乙素相对校正因子的影响。结果，相对校正因子RSD均小于2%，表明不同仪器和色谱柱对白花前胡甲素和白花前胡乙素相对校正因子无显著影响。

2.7.6.2 不同柱温、流速和波长对相对校正因子的影响

取同一份对照品溶液，在“2.7.1”色谱条件下测定峰面积，在 Agilent 1200高效液相色谱系统上，考察不同柱温(25，30，40℃)，流速(0.6，0.8，1.0 mL/min)和波长(318，321，324 nm)对白花前胡甲素和白花前胡乙素相对校正因子的影响。结果，相对校正因子RSD均小于2%，表明不同柱温、流速和波长对白花前胡甲素和白花前胡乙素相对校正因子无显著影响。

2.7.7 样品测定

取各批次样品配制的供试品溶液，在“2.7.1”色谱条件下测定峰面积，带入回归方程求得含量。结果，9批前胡总香豆素提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量分别为602.42～721.44 mg/g和38.34～101.46 mg/g。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器，在190～900 nm波长下分别对供试品溶液和对照品溶液进行全波长扫描，在318～324 nm波长范围内，两种溶液有最大吸收峰，故采用321 nm作为测定波长[9]。

3.2 SFE技术提取前胡香豆素优势明显

SFE技术是近年来一项中药提取新技术，具有低温、高效、无溶剂残留等优点。通过工艺参数优化，SFE提取前胡香豆素类成分的效率更高[8-11]，更适合工业化生产。

3.3 总香豆素提取物与饮片中前胡甲素和前胡乙素含量呈正相关

试验选取的9批前胡饮片，按照《中国药典》2015年版一部[1]前胡饮片标准检验合格，白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量分别为10.01～17.76 mg/g和3.02～6.31 mg/g，各批次含量差异较明显。前胡SFE提取物中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量，与各批次饮片中相应成分含量呈正相关。