霾黄金中药茶急性毒理试验研究

刘芳，马婷婷，汪蕾，江绍伟，肖凌*

(1.协和武汉红十字会医院急诊科，湖北 武汉 430010；2.湖北中医药大学检验学院，湖北 武汉 430065)

近些年来，随着空气质量逐渐恶化，雾霾出现的频率越来越高，雾霾中含有很多颗粒性污染物，在PM2.5相关的研究中[1-3]发现，主要引起肺部的炎症和氧化应激反应。运用传统医学采用中药预防是可行的方法。根据专利“一种清肺润肺茶的生产方法”(专利号：ZL201410124446.5)生产的清肺润肺茶霾黄金，主要由清肺润肺健脾的药食同源中药制成，用于对雾霾伤害的预防，成分包括玉竹、罗汉果、甘草、橘皮、芦根、薏苡仁、余甘子、百合(按剂量高低排列，具体剂量受专利保护)8味中药。本试验拟对霾黄金进行毒理试验，对霾黄金安全性作进一步研究。

罗汉果具有清热润肺、利咽开音和滑肠通便作用。芦根具有清热泻火、生津止渴、除烦止呕作用，但脾胃虚寒者慎服芦根。百合具有养阴润燥、清心安神作用，目前几乎未有相关毒副作用的报道。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳的作用。薏苡仁具有利水渗湿、健脾止泻、排脓解毒的作用，也对癌细胞有阻止生长和杀伤作用，但消化功能弱者慎食。陈皮具有理气健脾、燥湿化痰的作用，急性毒性作用小。余甘子具有生津止咳、清热凉血、消食健胃的作用，其暂未查到明显毒理作用。玉竹的有毒成分为铃兰苷或苓兰苷，过量可引起中毒。综合以上内容，我们设计了急性毒理试验，重点评估霾黄金中药茶对胃肠功能、肝肾功能及血糖的影响。

试验采用最大耐受法对小鼠进行急性毒理试验，通过观察小鼠在灌胃后的饮食和排泄情况，统计体质量变化评估其对胃肠功能的影响；通过检测小鼠血清的相关生化指标及肝肾病理切片评估其对肝肾功能，检测血清葡萄糖评估霾黄金中药茶对血糖的影响。

1 材料与方法

1.1 试验对象

40只SPF级昆明小鼠购自三峡大学试验动物中心(动物合格证号：No42010200002114,单位许可证编号：SCXK(鄂) 2017-0012)，日龄为35～37 d。购买后在适宜温度和湿度下适应性饲养1周后，40只KM小鼠平均体质量为(29.87±1.58)g。

1.2 分组方法

将适应性饲养后的40只KM小鼠随机编号，然后通过产生1～40之间的随机数的方法先后分为A,B,C,D四组，每组10只。试验期间，参考动物试验通用要求，遵循相关动物保护和使用指南，并获得单位伦理委员会批准。

1.3 试验试剂与器材

霾黄金(取自商品霾黄金伴侣茶，许可证编号：SC10642011801427，2018/07/15)；离心机(北京京立离心机有限公司，型号：LD5-2A)；生化试剂盒葡萄糖(批号：180851)、肌酐(批号：180651)、总蛋白(批号：180791)、甘油三酯(批号：191041)均来自中生北控生物科技股份有限公司；分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司，型号：723N)。

1.4 试验方法

40只KM小鼠分为A,B,C,D四组，A组为对照组(灌相应体积的去离子水)，B,C,D组受试物剂量设3个剂量组(正常剂量的1倍，10倍，100倍)。

1.4.1 剂量换算

霾黄金一包为的剂量为1.5 g，参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》[4]，根据体表面积换算法，人和小鼠(20 g)间按体表面积折算的等效剂量比值为0.002 5，算得相当于小鼠剂量为0.187 5 mg/g。A,B,C,D四组的剂量分别为0，0.187 5，1.875，18.75 mg/g。但100倍正常剂量时溶液呈高度黏稠状无法进行灌胃，所以统一将浓度稀释50%后分2次灌胃，小鼠灌胃容量为0.015 mL/g，每日灌胃溶液需新鲜配制。

1.4.2 灌胃

用1 mL的注射器配已消毒灭菌的8号灌胃针头对小鼠进行灌胃。各组小鼠灌胃前隔夜停食16 h(不限制饮水)，第1次灌胃结束后将小鼠放回笼中，间隔4 h后进行第2次灌胃，并且每次灌胃前需禁食禁水2 h。每日灌胃结束后投放饲料和水供小鼠自由饮食，期间并记录小鼠的死亡情况，观察小鼠的行为，外观，对刺激的反应，排泄物及分泌物情况，连续灌胃10日。

1.4.3 取材

摘眼球取血：于第14日对小鼠禁食24 h后，采用摘取眼球的方法对小鼠进行采血。将采集的血液置于干燥的EP管内，静止0.5 h后3 500 r/min离心10 min(离心力为2 100 g,离心半径约15 cm)，吸取每管的上层血清于新的干燥EP管内，贴好标签，于4 ℃冰箱内保存。

小鼠肝肾取材：眼球取血后的小鼠立刻进行解剖，取小鼠的肝脏和肾脏，取得的脏器置于装有组织固定液(4%多聚甲醛)的EP管内固定保存，外送石蜡包埋。

1.4.4 病理切片制作

取回的石蜡包埋好的脏器固定于切片机上切成5～8 μm的薄片，切下的薄片展于40 ℃水浴并用镊子将蜡片分离开，选择最佳的薄片，置于载玻片上放入37 ℃烤片机中24 h晾干[5]。晾干后的切片进行HE染色，最后封片并加盖盖玻片，在显微镜下进行镜下观察。

1.4.5 指标测定

生化指标的检测：用分光光度分析的标准曲线法对取好的小鼠血清进行生化指标的测定。

1.5 统计学方法

本试验采用t检验进行统计学分析，运用的统计学软件为SPSS 23.0。

2 结果

2.1 灌胃后小鼠体质量饮食行为记录

第1天，第7天和第14天的平均体质量记录见表1，从数据和结果中看出各组小鼠的体质量持续增长，且试验组小鼠体质量与对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。

试验期间未见小鼠死亡。灌胃期间小鼠的进食进水及行动应激能力并无异常，观察小鼠排泄物，可见D组小鼠大便颜色略深，其余性状并无异常。

表1 灌胃期间小鼠体质量表

2.2 生化指标测定结果

取得的小鼠血清均为黄色透明，新鲜无溶血。用标准曲线法求得葡萄糖，总蛋白，肌酐，甘油三酯的相应浓度，对每组的各项生化指标的平均值进行统计学指标计算及差异分析见表2。

表2 小鼠血清生化指标

从表中可看出试验组B,C,D组的葡萄糖，总蛋白，肌酐，甘油三酯测量值与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3 组织病理学

小鼠肝，肾HE染色的片子在正置显微镜下进行组织形态观察，拍摄的图片见图1，图2。从病理切片染色结果可看出与对照组A组相比，试验组B,C,D组小鼠的肝肾并未出现炎症改变、细胞水肿、脂肪变性等急性毒理改变。

图1 小鼠肝脏石蜡切片HE染色(从左到右分别为A,B,C,D组，×400)

图2 小鼠肾脏石蜡切片HE染色(从左到右分别为A,B,C,D组，×400)

3 讨论

近年来大气污染问题日益严重，雾霾天气及其主要成分 PM2.5成为危害人体健康的重要元凶，在相关研究中，雾霾可通过影响肺组织ATP的产生和免疫功能来引起肺功能的损伤[6-7]。霾黄金中药茶是一种清肺润肺中药茶，在研究其对雾霾损伤的防护作用之前做了此次急性毒理试验。

急性经口毒性试验传统方法可分为霍恩氏法，寇氏法[8]。但本试验为中药保健茶，测LD50较为困难，故参考相关文献[9-12]，本试验采用最大耐受法对小鼠进行急性毒理试验，灌胃剂量分别设为正常剂量的1倍，10倍和100倍。由于该产品10 d为1周期，故对小鼠连续灌胃10 d。根据GB 15193.1-2014食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序，动物毒性试验结果外推到人的不确定系数通常为100，本试验中最大剂量组为正常剂量的100倍。

霾黄金中药茶为八种药食同源中药进行配伍制备，其主要功效是清肺润肺健脾。急性毒理试验主要涉及其对小鼠胃肠和肝肾功能影响进行评估。鉴于霾黄金茶口感回甘，本试验亦对试验小鼠血糖进行评估。试验结果显示，试验组的小鼠在连续灌胃后体质量，饮食，行为和排泄情况等均无异常，胃肠功能正常；试验组小鼠血清总蛋白、肌酐、甘油三酯与对照组相比差异均无统计学意义，HE染色的病理切片分析，未见试验组小鼠的肝肾发生病理学改变，表明霾黄金中药茶对肝肾功能无影响。试验组小鼠血清葡萄糖与对照组无统计学差异，显示其对血糖无影响。综上，润肺清肺中药茶霾黄金不影响小鼠胃肠功能、肝肾功能及血糖，不引起急性毒理改变，使用安全。