两种前列腺素抑制二磷酸腺苷诱导血小板聚集强弱的体外对比

夏 晴，李 艺，李 薇，胡惠静，陈 云，阮竞雄

依前列醇，又名前列腺素I2(prostaglandin I2, PGI2)，为血管内产生的一种天然前列腺素，是强效的血管扩张药及抗血小板聚集药[1,2]。其抗血小板聚集的作用机制可能为本药激活腺苷酸环化酶，而使血小板内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, AMP)浓度上升所致。临床上用于治疗不稳定型心绞痛、心肌梗死、顽固性心力衰竭、外周血管痉挛性疾病及肺动脉高压[3,4]。前列地尔，又称前列腺素E1(prostaglandin E1, PGE1)，可增加血管平滑肌细胞内的cAMP含量，发挥其扩血管作用，具有恢复红细胞变形能力、增加动脉血流量、促进侧支循环、降低外周阻力、降低血液黏度的作用，同时可抑制血小板聚集[5，6]。临床上以脂微球为药物载体的静脉注射用前列地尔制剂，主要用于治疗慢性动脉闭塞症(血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症)引起的四肢溃疡及微小血管循环障碍引起的四肢静脉息痛，起到很好地扩血管抑制血小板聚集作用[7]，广泛用于脑梗死[8]、糖尿病并发症、耳鸣及慢性肝炎[9]，还可用于高血压视网膜病变[10]。目前，研发拮抗ADP诱导血小板聚集的药物已成为热点问题，并取得了一定的研究成果[11]。本研究旨在探讨依前列醇钠、前列地尔对血小板聚集的影响程度及作用强弱，以便为其临床应用提供药理理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 Sysmes XS-800i 全自动血细胞分析仪(日本希森美康公司)； Helena Aggram 四通道血小板聚集仪(美国海伦娜公司)；Sartorius BS224S天平(德国赛多利斯公司)；高速冷冻离心机Sigma 3-30K(德国Sigma离心机股份有限公司)。

1.1.2 材料 SD雄性大鼠250～300 g，20只(西安交通大学医学院提供)；依前列醇钠(Caymanpharma s.r.o.，批号1605V011)；前列地尔(吉林英联生物制药股份有限公司，批号20150401)；甘氨酸(天药药业股份有限公司，批号AGLY140707)；磷酸氢二钠(湖南九典制药，批号201601105)；磷酸二氢钠(成都华邑药业辅料，批号20120402)；3.2%枸橼酸钠抗凝管(w/v，西安交通大学第一附属医院提供)；氢氧化钠(天津市天力化学，批号20160708)；实验用水为纯化水。

1.2 实验方法

1.2.1 血小板混悬液的制备 SD雄性大鼠且最近2周内未服用过影响血小板功能的药物，10%水合氯醛麻醉后，腹腔静脉取血置于加有3.2%枸橼酸钠的抗凝管中，800 r/min下离心10 min，吸取上层的富血小板血浆(PRP)，4000 r/min下离心10 min，吸取上层的贫血小板血浆(PPP)。用PPP稀释PRP最终血小板数为400×109个/L，作为最终血小板混悬液待用。血小板聚集实验在采集血标本后3 h内进行。

1.2.2 缓冲溶液配制 甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH=10.4)：称取1.5049 g甘氨酸、0.8018 g氢氧化钠分别溶解在100 ml注射用水中，制得0.2 mol/L水溶液；量取25 ml上述甘氨酸水溶液加入19.3 ml上述氢氧化钠水溶液混匀后，加入注射用水定容至100 ml得甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液。

磷酸盐缓冲溶液(pH=7.5)：称取7.1640 g磷酸氢二钠，2.7625 g磷酸二氢钠分别溶解在100 ml注射用水中，制得0.2 mol/L水溶液；取84 ml上述磷酸氢二钠水溶液加入16 ml上述磷酸二氢钠水溶液混匀后即得。

1.2.3 药液的配制 精密称取5 mg依前列醇钠置

于10 ml量瓶中，临用时用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液溶解定容，配制质量浓度为500 μg/ml溶液待用；同理，精密称取5 mg前列地尔置于10 ml量瓶中，用1.2.2项下配制的磷酸盐缓冲液溶解定容，配制成质量浓度为500 μg/ml溶液待用。然后分别用各自缓冲溶液稀释至50、125、250、500和2500 ng/ml。

血小板聚集仪自带ADP试剂，用1 ml蒸馏水复溶1瓶试剂，轻轻混合直至完全溶解至浓度为200 μM，复溶后试剂保存在2～6 ℃可稳定1周，工作液应在制备后3 h内使用。使用时用蒸馏水稀释至所需浓度。

1.2.4 最佳孵育时间的确定 血小板混悬液中分别加入依前列醇钠500 ng/ml、前列地尔500 ng/ml，37 ℃下孵育不同时间(0、1、3、5、10、15 min)，在相同的ADP浓度(20 μM)诱导下测定5 min内最大聚集率。

1.2.5 最佳ADP终浓度的确定 血小板混悬液中加入依前列醇钠500 ng/ml、前列地尔500 ng/ml，37 ℃下孵育相同时间(由1.2.4确定)，在不同浓度的ADP诱导下(5、10、20、40 μM)测定5 min内最大聚集率。

1.2.6 样品处理 225 μl血小板混悬液中分别加入空白试剂(0，对照组)、50、125、250、500、2500 ng/ml的依前列醇钠或前列地尔20 μl，37 ℃下孵育相同最佳时间后加入20 μl最佳浓度的ADP诱导，依次检测各浓度5 min内最大聚集率，计算血小板聚集抑制率，计算公式如下：

血小板聚集抑制率(%)=

2 结 果

2.1 不同孵育时间对血小板聚集的影响 随着孵育时间的延长，两组对ADP诱导的血小板聚集均呈现出逐渐降低的趋势，直至5 min往后血小板聚集率变化无统计学意义差异(P>0.05，表1)。

表1 大鼠两种前列腺素(500 ng/ml)不同孵育时间的血小板聚集率

注：与前一时间点相比，①P<0.05

2.2 不同ADP终浓度对血小板聚集的影响 血小板混悬液中血小板数控制在400×109个/L，孵育最佳时间为5 min，加入20 μl不同浓度的ADP，随着ADP浓度的增加血小板聚集率呈增加趋势。20 μmol/L与10 μmol/L相比具有统计学意义差异(P<0.05)，与40 μmol/L相比差异无统计学意义(表2)。

表2 大鼠两种前列腺素(500 ng/ml)不同ADP浓度的血小板聚集率

注：与5 μmol/L比较，①P<0.05；与10 μmol/L比较，②P<0.05

2.3 不同浓度的依前列醇钠、前列地尔对血小板聚集的影响 依前列醇钠和前列地尔随着浓度的增加，血小板最大聚集率依次减小，与各自溶剂组相比均显著降低。依前列醇钠组血小板抑制率显著高于前列地尔组，250 ng/ml的依前列醇钠对血小板的抑制率已经高达88.61%，而前列地尔仅有23.16%。2500 ng/ml的前列地尔血小板抑制率为65.09%，较250 ng/ml的依前列醇钠血小板抑制率降低(表3)。

表3 大鼠不同浓度依前列醇钠、前列地尔的血小板聚集率和抑制率

注：-表示无法计算；与无加药组相比，①P<0.05；与前列地尔等同浓度相比，②P<0.05；与前列地尔等浓度相比，③P<0.05时t值和P值

3 讨 论

血小板在不同患者、不同疾病和不同疾病阶段中所起的作用不同，影响血小板聚集的因素很多，因此应通过实验研究为开发新型的具有抗血小板作用的药物是非常有必要的，而血小板聚集是血小板活化及其释放反应、膜糖蛋白受体等综合因素的共同表现，其聚集率的检测，已被广泛应用于血栓性疾病及出血的诊断、治疗和疗效评估[12]。

依前列醇钠是花生四烯酸的代谢物，具有有效血管扩张活性和血小板聚集抑制活性，是唯一一个进入肺循环不被降解，可发挥全身作用的前列腺素类物质[13]。前列地尔是前列腺素的一种，也具有扩张血管和抑制血小板聚集的活性。本试验比较了两者在体外抑制ADP诱导血小板聚集作用的强弱。

研究发现，依前列醇钠很不稳定，在人体血液环境中很快降解失活。依前列醇钠在23 ℃、pH 7.2水溶液中半衰期仅为0.033 h，在碱性pH 8.9水溶液中半衰期为4.4 h、pH 9.3情况下半衰期可达到10.33 h，在pH 10.2～10.8依前列醇钠最稳定[14,15]，故本试验采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH 10.4)作为依前列醇钠溶剂。依据中国药典有关前列地尔溶解性的记载，即前列地尔可溶解与pH 7.5磷酸盐缓冲溶液中，故本实验采用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH 7.5)作为前列地尔的溶剂。二磷酸腺苷 (ADP) 是第1个已知的低分子血小板弱聚集诱导剂，可诱导初级聚集和致密颗粒分泌[16]，通过作用于多种受体，增强自身及其他诱导剂对血小板的诱导作用并有助于血栓的稳定[17]，本实验采用ADP作为血小板聚集诱导剂，在最佳孵育时间和最佳ADP浓度，依次分别加入不同浓度的依前列醇钠和前列地尔测定5 min内最大聚集率，并计算最大抑制率。

试验结果表明，大鼠静脉取血，制备得400×109个/L血小板混悬液，ADP最佳诱导浓度为20 μM，加入药物最佳孵育时间5 min。依前列醇钠50 ng/ml、前列地尔250 ng/ml以上浓度均可显著抑制血小板聚集。依前列醇钠具有较强的血小板聚集抑制率，500 ng/ml时最大抑制率可达93.90%。前列地尔也可抑制血小板聚集，但其作用强度远弱于依前列醇钠，500 ng/ml时最大抑制率仅有28.10%，同等浓度下，依前列醇钠抑制血小板聚集的作用要显著强于前列地尔。这与体内研究结果相吻合，即体内研究表明依前列醇钠是一种强有力的血小板抑制剂，其作用效果是前列地尔的20倍。

综上所述，依前列醇钠是一种作用强度远强于前列地尔的血小板聚集抑制剂，为依前列醇钠用于治疗血小板聚集引起的相关疾病奠定了理论基础，也为治疗血小板聚集相关疾病提供了一种更强有力的选择。