Occludin蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及其与患者临床病理指标的相关性

白 璐 王 涛 张 喆 贡 雪 朱秀坤 姜彦多

（1 沈阳金域医学检验所有限公司，辽宁 沈阳 110000；2 中国医科大学附属盛京医院病理科，辽宁 沈阳 110000；3 中国人民解放军第202医院病理科，辽宁 沈阳 110000）

乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤首位，目前仍旧是世界性难题。转移是导致乳腺癌患者治疗失败的重要原因，预示着肿瘤患者的复发和较差的预后状态[1]。闭合蛋白（Occludin）是一种紧密连接蛋白，在多种肿瘤中低表达[2-4]，并与恶性生物学行为转移相关，然而目前尚无Occludin蛋白在乳腺癌中的报道。本文通过免疫组化方法，初步探索了Occludin蛋白在乳腺癌中的表达水平及在乳腺癌进展过程中的潜在作用。

1 资料与方法

1.1 主要试剂：鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa cruz公司（SC-434）；免疫组织化学染色试剂盒、抗原修复液、苏木素染料、PBS缓冲液均购自北京中杉金桥公司。

1.2 患者情况：本实验选用中国医科大学附属第二临床学院2011年～2014年在乳腺外科接受手术治疗的乳腺浸润性导管癌患者118例，患者年龄平均31～77岁中位年龄53岁，选用乳腺腺病患者20例作为对照组。其中乳腺浸润性导管癌Ⅰ级3例，Ⅱ级98例，Ⅲ级17例。淋巴结情有转移53例，没有转移65例。

1.3 免疫组织化学染色方法：组织切片为3 μm厚，切片烤片后再二甲苯中进行切片浸泡脱蜡，随后经过酒精水化去除多余二甲苯；采用EDTA抗原修复液进行高压热修复；采用过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶；Occludin蛋白的稀释浓度为1∶100，每张切片滴加100 μL后4 ℃隔夜孵育；次日用二抗反应40 min；DAB显色剂现用现配，在显微镜下观察显色强度并及时终止反应。苏木素染核后用中性树胶封片。

1.4 结果判读：Occludin蛋白的阳性为细胞膜呈线条状棕黄色染色。染色强度的评分采用色强度与面积的乘积分析。染色强度0分为无染色，1分为淡黄色，2分为深黄色，3分为棕褐色；染色面积1分为≤10%细胞膜阳性，2分为11%～50%细胞膜阳性，3分为51%～74%细胞膜阳性，4分为＞75%细胞膜阳性。乘积结果以0～3分为阴性，4～12分为阳性。

1.5 统计分析：应用统计分析软件SPSS22.0进行分析，阳性率之间比较使用卡方检验，临床病理指标与Occludin蛋白之间的相关性采用斯皮尔曼等级相关，检验水平为α=0.05，P＜0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 Occludin蛋白在乳腺正常组织中及乳腺浸润性导管癌组织中的表达：Occludin蛋白的免疫组织化学染色结果见图1。在118例乳腺浸润性导管癌患者中有60例阳性，而在20例乳腺腺病患者中有18例阳性。Occludin蛋白在乳腺癌组织中的阳性率（50.84%）显著低于癌旁组织(90.00%)，差异有统计学意义（P=0.001，χ2=10.668）。

图1 乳腺浸润性导管癌组织中Occludin蛋白的免疫组织化学染色（PV，×200）

2.2 Occludin蛋白与乳腺浸润性导管癌患者临床病理指标的相关性：以病理报告为准统计临床病理指标，相关性分析结果见表1。结果发现Occludin蛋白与患者年龄、肿瘤最大径、组织学分级、PR、Her2及Ki67无关。Occludin蛋白的表达与患者雌激素受体ER（P＜0.05）、淋巴结转移情况（P＜0.05）、脉管癌栓（P＜0.05）呈负相关，Occludin蛋白表达缺失更多出现于淋巴结有转移患者中（62.26% vs 38.46%）。见表1。

表1 Occludin蛋白与乳腺浸润性导管癌患者临床病理指标的相关性[n（%）]

3 讨论

在我国乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤首位，年新发病例约20余万，死亡病例达6万，成为严重威胁女性健康的重大疾病[1]。一旦肿瘤发生转移或早期入血变成循环的肿瘤细胞，术后就存在复发转移的可能，因此浸润转移是影响乳腺癌患者预后的关键因素。深入探讨乳腺癌的转移机制，探寻治疗的新策略，将大大改善患者的预后。

细胞间紧密连接（TJ）表现出复杂的分子结构，涉及ZO-1、Claudins、Occludin等的共同作用，为上皮和内皮组织提供结构完整性[5]。大量研究表明，Occludin蛋白在维持细胞屏障功能方面发挥着重要作用，参与调控肌动蛋白、维持细胞极性以及调控各种信号传导途径转录。Occludin 蛋白广泛的生理学功能意味着其表达缺失会产生严重后果，紧密连接的失调参与了许多疾病的发生发展过程，是一种重要的病理生理学标志[6]。研究中发现，Occludin的蛋白表达水平在食管癌[2]、子宫内膜癌[3]、口腔鳞状细胞癌[4]等多肿瘤组织中显著下调。目前Occludin蛋白在乳腺癌组织中的研究鲜见报道，我们的研究结果表明：癌组织中Occludin 蛋白的表达水平显著低于正常乳腺组织，提示Occludin蛋白在乳腺癌的发生过程中可能发挥着抑制性的作用，与大部分学者在其他肿瘤中的研究结论一致。

肿瘤细胞发生转移是一个涉及多因素复杂的调控过程，肿瘤细胞发生转移的前提是肿瘤细胞间连接减弱，单个肿瘤细胞从原发灶或转移灶脱落进入外周血循环形成循环肿瘤细胞，发生肿瘤播散或远处转移[7]。Occludin蛋白作为细胞间连接的重要组成部分，可能参与调控了肿瘤细胞的转移过程。有研究表明Occludin蛋白的表达缺失介导了肿瘤的骨转移[8]。在本研究中，我们通过分析临床病理参数，证实了在乳腺浸润性导管癌肿瘤组织中Occludin蛋白的表达与患者肿瘤转移状态呈显著的负相关，与既往文献报道的Occludin蛋白缺失促进肿瘤转移的结论一致。

综上所述，Occludin蛋白在乳腺癌组织中低表达，且与患者ER状态、淋巴结转移、脉管癌栓密切相关，提示Occludin蛋白在乳腺癌的进展过程中发挥着重要的作用，且可能参与调控了乳腺癌细胞的转移。临床检测Occludin蛋白可能对患者预后做出更为精准的预判。