癌基因C-jun及其缺失突变体过表达细胞株的构建与鉴定

余斯琦，朱长军

（1.天津师范大学生命科学学院， 天津 300387； 2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室， 天津 300387；3.天津师范大学 分子细胞系统生物学重点实验室，天津 300387）

转录因子C-jun 基因作为原癌基因， 在多种癌变器官中呈现高表达，如肺癌、宫颈癌、乳腺癌[1-4]等.C-jun 在子宫内膜癌中的表达量也较高， 并且能够与类固醇生成因子1 和肝脏受体同源物1 结合促进子宫内膜癌的增殖.研究[5-6]表明，C-jun 的表达水平与患者临床病理特征和预后密切相关， 预示着C-jun 可作为肿瘤发生发展的重要指标.

C-jun 全长331 个氨基酸，包括两大功能域：转录因子激活功能域和亮氨酸拉链bZIP 功能域（含DNA结合功能域）， 属于Jun 家族蛋白.Jun 家族成员主要包括 C-Jun、Jun B 和 Jun D.Jun 家族可与 Fos 家族（包括 C-Fos、Fos B、Fra1 和 Fra2）通过亮氨酸拉链 bZIP 结构组成二聚体，其中最为稳定的转录因子二聚体AP-1就是由C-jun 和C-Fos 聚合而成[1].C-jun 在细胞中参与调控细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程[7]，它主要通过行使自身的转录功能来调控多种蛋白的表达，进而完成对细胞生理过程的调节.当它发挥转录功能时，C-jun 氨基端激酶（JNK）对 C-jun 的 N 端进行磷酸化，使其能够二聚化形成同型或异型二聚体[1]，并增强其二聚体的稳定性，进而促进转录[8].C-jun 在细胞中能够转录 WT1[9-10]、Keratin 5[11-12]、Id2A[13-14]等多种与细胞生理活动相关的蛋白.其中，C-jun 通过转录WT1，使得WT1 在有丝分裂时期与MAD2、BUBR1 等结合，从而抑制细胞有丝分裂后期促进复合物APC（anaphase promoting complex）对 Cyclin B1 的降解作用[10].因此，C-jun 对于细胞的正常生长分裂具有重要意义.

C-jun 作为一个重要的转录因子， 其下游靶基因已见文献报导，这些基因都参与细胞分化[15]、增殖[10]、凋亡[16]等重要生命过程.本研究通过细胞转染、点突变、药物筛选等方法，获得Flag-C-jun 和Flag-C-junmut稳定表达的HelaS 细胞株， 并用蛋白印记杂交和细胞免疫荧光染色方法对细胞株进行验证，为进一步筛选转录因子C-jun 的下游靶基因， 研究其调控细胞生命活动的作用机制奠定实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 质粒和细胞

pFlag-c-jun 表达质粒， 购于优宝生物公司；HelaS细胞，由天津师范大学分子细胞系统生物学重点实验室提供.

1.1.2 主要试剂和工具酶

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶），美国 Vazyme 公司；BamH1、Xho1 限制性内切酶、转染试剂Turbofect，美国Thermo Scientific 公司；琼脂糖（REGULAR AGAROSE G-10），法国 BIOWESTE 公司； Gelred，美国 Biotium 公司；DMEM 细胞培养基，以色列Biological Industries 公司；FBS，美国HyClone 公司；G418，北京索莱宝科技有限公司；Opti-MEM 培养基，美国 Gibico 公司；Super DNA Marker，北京康为世纪生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 Flag-C-jun DNA 结合功能域缺失突变体质粒的引物序列设计

以NCBI 上提供的C-jun cDNA 参考序列（NM_002228）作为模板，根据其DNA 结合功能域位置设计点突变PCR 引物，引物序列如表1 所示，引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成.

表1 pFlag-C-jun DNA 结合功能域缺失突变体质粒引物设计Tab.1 Primer design of pFlag-C-jun DNA binding domain deletion mutant

1.2.2 点突变

以pFlag-c-jun 质粒为模板，加入Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶、dNTP、 引物、buffer 进行 PCR 扩增.PCR 扩增程序如下：95 ℃ 30 s 预变性，95 ℃ 30 s 变性，64 ℃ 1 min 退火，72 ℃ 7 min 延伸，16 个循环；72 ℃10 min 终延伸，4 ℃保存.得到的PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，验证无杂带后用Dpn I 酶切1 h（水浴37 ℃），再次 DNA 电泳验证无误后，将 PCR 产物转入感受态细胞进行扩增， 所得质粒送至生物公司测序，验证无误后获得突变体质粒.

1.2.3 质粒转染

用含 10%FBS 的 DMEM 培养 HelaS 细胞.将HelaS 细胞接种于24 孔板中，每孔3×104个细胞，24 h后将配制好的转染试剂（每孔含质粒250 ng、Turbofect 0.5 μL、Opti-MEM 100 μL） 边摇边加至 24 孔板中，放入细胞培养箱（CO2体积分数为5%， 37 ℃）中培养24～48 h.

1.2.4 稳筛细胞株的构建

将HelaS 细胞接种于24 孔板中，每孔细胞数量为3×104个，铺4 个孔.其中，空白对照和转染pFlag-c-jun或pFlag-c-junmut质粒各2 个孔，48 h 后从空白对照和质粒转染的细胞中各取一孔做Western blot， 测定Flag-C-jun 蛋白表达.将另一孔中的细胞（对照细胞和转染后的细胞） 用胰酶消化后转至10 cm 平板使细胞分散开，用含有750 ng/μL G418 的 DMEM 进行培养.5 d 后换液， 直至细胞形成单克隆.挑取细胞克隆至24 孔板进行培养.细胞正常生长后，取1/2 细胞进行Western blot 检测是否有 Flag-C-jun 或 Flag-C-junmut的表达，将能够表达Flag-C-jun 或Flag-C-junmut的细胞转至10 cm 平板进行正常细胞传代培养.

1.2.5 蛋白质印迹杂交

用配制的SDS 裂解液收集细胞，得到全细胞裂解液后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，再通过半干型转印电泳槽将蛋白转至PVDF 膜，转膜1 h.脱脂奶粉封闭 0.5 h，一抗室温孵育 2 h（M α tubulin，RT 2 h；M α Flag，RT 2 h），TBST 洗 3 次，二抗室温孵育 1 h（G α mouse HRP），加入 ECL 和过氧化氢后曝光.

1.2.6 细胞免疫荧光染色

细胞计数后，在细胞爬片上每孔铺3×104个细胞，待密度大约为80%～90%时取出爬片，PBS洗3次，用甲醇-丙酮固定液固定5 min，再次用PBS 清洗3 次.用山羊血清配成的封闭液封闭0.5 h，用0.1% PBS-TX洗3 次.加入0.1% PBS-TX 稀释的一抗稀释液， 室温孵育 2 h（M α Flag，RT 2h）.PBS-TX 洗 3次，加入0.1% PBS-TX 稀释的二抗稀释液， 室温避光孵育1 h.二抗结束后， 加入 0.1% PBS-TX 稀释的DAPI，0.1%PBS-TX 洗3 次后加入抗荧光猝灭剂， 用指甲油将细胞爬片的周围密封，置于荧光显微镜下观察.

2 结果与分析

2.1 真核细胞表达质粒pFlag-c-jun的酶切鉴定

pFlag-c-jun 质粒全长 6 445 bp，其中 c-jun 的 cD NA全长为996 bp.根据图1 的质粒图谱可以看出，pFlag-c-jun 质粒经BamH1 和Xho1 双酶切后，通过1%琼脂糖凝胶电泳能够看到一条约为1 005 bp 的条带，与目的基因的长度大致相符，同时还有一条长度约为5 440 bp 的条带，与载体片段大小一致，因此酶切验证该质粒正确.

2.2 构建Flag-c-jun DNA结合功能域缺失突变体质粒pFlag-c-junmut

根据NCBI 上查找到的C-jun 的DNA 结合功能域（图2），通过点突变的方式将该区域去除，琼脂糖凝胶电泳验证后（图3），用获得的质粒转化感受态细菌.将生长的单克隆细菌小量扩增后小提质粒，送至生物公司测序.通过比对测序结果可以得知， 本研究已成功将C-jun DNA 结合功能域去除（图4）.

图1 质粒pFlag-c-jun 的酶切鉴定结果Fig.1 Identification of plasmid of pFlag-c-jun

图2 C-jun 的氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of C-jun

图3 pFlag-c-junmut 点突变琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis results of pFlag-c-junmut point mutation

图4 pFlag-c-junmut 点突变测序结果比对Fig.4 Alignment of pFlag-c-jun and pFlag-c-junmut sequences

2.3 Flag-C-jun和Flag-C-junmut稳定表达细胞株的构建

成功得到真核细胞表达质粒pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut后， 构建能够稳定表达 Flag-C-jun 和Flag-C-junmut的稳筛细胞株.分别转染pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut质粒，48 h 后收集细胞进行 Western blot，结果如图5 所示.由图5 可以看出，2 个质粒在转染48 h 后均有表达.随后用含有G418 的培养液继续培养，挑取单克隆移至24 孔板后， 收集部分细胞进行蛋白表达检测， 以瞬时转染的pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut作为对照， 直至选出能够稳定表达Flag-C-jun 和Flag-C-junmut的细胞株.由图6 可以看出， 转染了质粒pFlag-c-jun 的细胞中，1 号细胞株能够稳定表达Flag-C-jun.由图7 可以看出， 转染了pFlag-c-junmut的细胞中，2 号细胞株能够稳定表达Flag-C-junmut.随后对2个筛选出来的细胞株进行免疫荧光染色， 结果如图8所示.由图8 可以看出， 细胞中有Flag-C-jun 和Flag-C-junmut的稳定表达，且均在细胞核内.

图5 pFlag-c-jun 和pFlag-c-junmut 质粒转染后Western blot 结果Fig.5 Western blot results of transfection of pFlag-c-jun or pFlag-c-junmut

图6 Flag-C-jun 稳定表达细胞株的构建Fig.6 Congstruction of Flag-C-jun cell lines

图7 Flag-C-junmut稳定表达细胞株的构建Fig.7 Construction of Flag-C-junmut cell lines

图8 Flag-C-jun 和Flag-C-junmut 稳定表达细胞株的免疫荧光染色Fig.8 Immunofluorescence staining of Flag-C-jun and Flag-C-junmut stable expressed cell lines

3 讨论

C-jun 是一种转录因子，同时也是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的下游关键成员之一.C-jun 参与调节多种细胞功能，包括细胞增殖、存活、分化、对紫外线辐射的反应、免疫反应和炎症等.C-jun可以帮助乙酰转移酶募集到RUNX2 启动子，进而完成对组蛋白3 特定位点的乙酰化促进RUNX2 的转录[17]；NMB（Neuromedin B）促进 C-jun 磷酸化，能够诱导COX-2 和 IL-6 的表达上调[18]；C-jun 是激活 AXL 的必不可少的转录因子， 促进与耐药相关的STC2-JUNAXL-ERK 通路[19]；C-jun 还参与 p53 的负调控，通过抑制p53 的表达降低p21 的积累，使得细胞周期能够顺利进行[20].

由于C-jun 在多个生理过程中都发挥着重要作用，因此作为一个转录因子，其转录底物的研究非常重要.本研究通过点突变的方法，将C-jun 序列中的DNA结合功能域切除， 使C-jun 无法形成二聚体与DNA 结合.在此基础上，分别构建了能够稳定表达Flag-C-jun和Flag-C-junmut的细胞株.这些细胞株的构建有助于进一步通过ChIP 实验研究转录因子C-jun 的下游关键靶基因， 为更加清晰深入地认识C-jun 的生物学功能提供实验基础.