一株木蹄层孔菌SO3高产漆酶发酵工艺及部分酶学特性研究

谢玉清，陈 竞，代金平，杨新平，古丽努尔·艾合买提，王志方，王小武，冯 蕾*

1新疆农业科学院微生物应用研究所；2新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐830091

漆酶最早于1883 年在漆树的汁液中发现，后来研究表明漆酶广泛存在于自然界中，如植物、真菌、细菌、动物及昆虫中[1]。漆酶属于蓝色氧化酶家族，是一种含铜的多酚氧化酶，以分子氧作为最终电子受体，是重要的木质纤维降解酶之一，还能催化降解多种芳香族化合物,特别是酚类[2]。因而漆酶作为一种绿色生物催化剂在生物质能源、纸浆生物漂白、染料脱色、废水处理、食品加工等领域具有广阔的应用前景[3]。

真菌漆酶比细菌漆酶、植物漆酶等具有更好的热稳定性、金属离子耐受性及更高的底物催化氧化性，在工农业及环境领域的应用中得到了较高的关注[4]。木蹄层孔菌属担子菌纲的白腐菌目，是漆酶最主要的生产者之一[5]。真菌漆酶的生产模式包括固态发酵和液体发酵，工业生产基本以液体发酵为主，而高酶活发酵工艺的优化及漆酶稳定性的研究是工业化生产漆酶的关键[6]。本研究对新疆阿勒泰山区分离筛选到的一株木蹄层孔菌(Fomesfomentarius)SO3菌产漆酶的发酵条件及部分酶学特性进行研究，为真菌漆酶的规模化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 实验菌种

木蹄层孔菌(Fomesfomentarius)SO3为本实验室从采自新疆阿勒泰山的菌种中分离筛选获得。

1.1.2 培养基

产酶基础培养基MF[7-9]：麦麸25 g，葡萄糖10 g，酒石酸铵1.84 g，NaCl 1.0 g、KH2PO42 g，琥珀酸钠1.18 g， VB110 mg，聚山梨酯-80 0.5 g，微量元素溶液70 mL，加水定容至1 000 mL，pH调至5.5。

微量元素组成：MgSO4·7H2O 3.0 g，MnSO4·H2O0.5 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KAl(SO4)2·12H2O 10 mg，H3BO310 mg，NaMnO4·2H2O 10 mg，加水定容至1 000 mL。

1.1.3 酶检测试剂

0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH 4.0)，0.5 mmol/L 2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，漆酶(laccase)。

1.2 实验方法

1.2.1 漆酶活力测定

采用ABTS[2，2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]法[10-12]。反应体系组成为:0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.0)1.95 mL、0.5 mmol/L 连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)2.00 mL和适当稀释的酶液50 μL， 28 ℃启动反应。并在3 min内连续测定反应液420 nm(ε=3.6×104mol/L/cm)处吸光值的增加值。该条件下，每分钟使1 μmol/L的ABTS氧化所需的酶量定义为1个活力单位(U)。

漆酶活力计算公式：漆酶活力(U/L)=(n×△A×106×V1)/(3.6×104×3×V2)

其中：n为酶液稀释倍数；V1为反应总体积；V2为反应酶液体积；△A为3 min内反应液在420 nm处吸光度的变化值；3.6×104为ABTS氧化态的摩尔吸光系数(mol/L/cm)。

1.2.2 产漆酶发酵条件的研究

1.2.2.1 不同碳源对发酵产漆酶的影响

采用单因素试验设计[13]，在基础培养基MF的基础上进行碳源替换，分别以0.5%的麦芽糖、蔗糖、甘油、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、淀粉、麦麸作为碳源，装液量50 mL/瓶，种子菌龄为5天，接种量5%，pH调至5.5，发酵7天后检测漆酶活性。

1.2.2.2 不同氮源对发酵产漆酶的影响

采用单因素试验设计，在基础培养基MF的基础上进行氮源替换，分别以0.5%干酪素、酵母粉、蛋白胨、硝酸铵、硫酸铵、磷酸二氢铵、酒石酸铵作为氮源，装液量50 mL/瓶，种子菌龄为5天，接种量5%，pH调至5.5，发酵7天后检测漆酶活性。

1.2.2.3 不同金属离子添加对发酵产酶的影响

以MF为产漆酶基础培养基，分别添加浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L的Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+，培养6天，测定漆酶的活性(U/L)。

1.2.2.4 不同诱导剂对漆酶活性的影响[14]

以MF为基础产漆酶培养基，pH调至5.5，装液量50 mL/瓶，种子菌龄为5天，接种量5%，接种后第二天添加不同诱导剂，诱导剂分别为藜芦醇、ABTS、没食子酸、单宁酸及愈创木酚，终浓度为0.025 mmol/L。分别在第3、5、7、9、11天测定酶活。

1.2.2.5 正交实验优化培养基

在MF基础产酶培养基基础上，各选择两种最优的碳、氮源进行组合，设计正交实验，选用L9(34)正交实验，具体组合如表1。

表1 培养基组成因素水平表

1.2.3 漆酶部分酶学特性研究

1.2.3.1 SO3漆酶的最适反应温度和热稳定性

在pH4.0的NaAc-HAc缓冲液中，在预试验基础上，分别在20、30、40、50、60、70、80 ℃条件下测定酶活，设定在50 ℃条件下测定的SO3漆酶活性为100%，确定漆酶最适反应温度；在上述不同反应温度下继续保温10 min后，再次测定漆酶活性，以反应起始的酶活为对照，计算残留酶活，确定其热稳定性。

1.2.3.2 SO3漆酶的最适反应pH

分别用pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制反应底物，测定漆酶活力。

1.2.3.3 SO3漆酶pH稳定性

将酶液加入pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液配制的底物，放入40 ℃的水浴中保温24 h，测定酶活。

1.2.3.4 不同金属离子对SO3漆酶稳定性的影响

用pH4.0的NaAc-HAc缓冲液配制FeCl2、MnSO4、NaCl、CoCl2、ZnSO4、CaCl2、MgSO4、CuSO4、KCl、CdCl2、CrCl3、PbCl2、AgNO3、BaSO4溶液，使其终浓度为4 mmol/L，在最适反应温度下，以不添加上述金属离子的反应体系作为对照，计算漆酶的相对活力。

1.2.4 SO3漆酶蛋白性质研究

1.2.4.1 SO3分泌蛋白SDS-PAGE分析

按最优的发酵条件获得漆酶发酵液，10 000 rpm、4 ℃、离心20 min，经过了30%～80%的硫酸铵分段盐析、Macro-Prep DEAE弱阴离子交换层析和Bio-Gel P-60 凝胶过滤层析系列纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析[15]。

1.2.4.2 SO3分泌蛋白双向电泳、漆酶等电点测定及主要蛋白质谱分析[16]

采用Bio-Rad蛋白质双向电泳系统测定木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶的等电点，将漆酶发酵液经过10 000 rpm、4 ℃、离心20 min后，分别收集上清液和沉淀，使用pH7.5、20 mmol/L的Tris·HCl缓冲液将沉淀冲洗4～5次，然后加入Tris·HCl缓冲液进行超声波破碎(冷却进行)后，10 000 rpm、4 ℃、离心10 min，取上清液进行透析过夜、浓缩至所需体积即可。上清液则可直接进行透析过夜、浓缩至所需体积。等电点聚焦使用了Bio-Rad的IPG预制胶条，pH为3.0～10，pH梯度为线性梯度，通过Bio-Rad PDQuest 2-D Analysis software软件分析获得酶蛋白等电点pI。第二向SDS-PAGE电泳对木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3发酵产酶高峰时的菌体及发酵液进行上样检测对比分析。并将表达量高的漆酶蛋白点切下进行质谱测序分析(委托北京军事医学科学院完成)。

2 结果与分析

2.1 产漆酶发酵条件的研究

2.1.1 不同碳源对SO3产漆酶的影响

基础产酶培养基以麦麸加葡萄糖(CK)的碳源组合酶活相对较高，为10 966 U/L，麦麸产酶活性为1 326 U/L，麦芽糖产酶活为313 U/L；添加蔗糖、甘油、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、淀粉替代基础培养基中的麦麸加葡萄糖均未检测到酶活(图1)，由此确定基础培养基MF中麦麸加葡萄糖的碳源组合为最佳。

图1 不同C源对SO3产漆酶的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on the production of SO3 laccase注：1.麦芽糖；2.蔗糖；3.甘油；4.葡萄糖；5.羧甲基纤维素钠；6.淀粉；7.麦麸；8.对照。Note:1.Maltose;2.Sucrose;3.Glycerin;4.Glucose;5.Carboxymethylcellulose sodium;6.Starch;7.Wheatbran;8.CK.

2.1.2 不同氮源对SO3产漆酶的影响

添加酵母粉替代原培养基中的酒石酸铵时，酶活最高，为7 566 U/L；其次为磷酸二氢铵，酶活为4 994 U/L；再次为蛋白胨，酶活为3 312 U/L；添加硝酸铵替代原培养基中的酒石酸铵时，酶活为1 224 U/L；添加硫酸铵和干酪素替代原培养基中的酒石酸铵时，酶活分别为1 155和1 080 U/L；而以酒石酸铵(CK)作为氮源时，酶活为1 113 U/L，由此确定，SO3产漆酶的最佳氮源为酵母粉，其次为(NH4)H2PO4(图2)。

图2 不同N源对SO3产漆酶的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources on the production of SO3 laccase注：1.干酪素(0.5%)；2.酵母粉；3.蛋白胨；4.硝酸铵；5.硫酸铵；6.磷酸二氢铵(0.5%)；7.酒石酸铵。Note:1.Casein(0.5%);2.Yeast extract powder;3.Pepton;4.Ammonium nitrate;5.Ammonium sulfate;6.Ammonium dihydrogen phosphate;7.Ammonium tartrate(CK).

2.1.3 不同金属离子浓度对产漆酶的影响

以不添加金属离子组(0 mmol/L)为对照(图3)， Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+的添加对SO3产漆酶有一定的促进作用，其中0.1 mmol/L的Mg2+、0.1 mmol/L和2 mmol/L Zn2+、0.2 mmol/L和0.5 mmol/L Ca2+的效果最明显。添加0.1 mmol/L的Mg2+在第7 d所测得的酶活由对照组的761 U/L增加至7 983 U/L， 0.1 mmol/L Zn2+在第7 d所测得的酶活由4 809 U/L增加到 9 870 U/L，Zn2+浓度在2 mmol/L时酶活由4 809 U/L 增加到9 774 U/L；Fe2+和Co2+的添加，漆酶产量较低，对产酶影响不明显；不同浓度Cu2+的添加都使酶活明显下降，说明Cu2+对产酶具有抑制作用。

2.1.4 不同诱导剂对SO3产漆酶的影响

由图4可知，添加没食子酸和单宁酸可使产酶高峰期由对照的第7天提前到第5天；添加ABTS可使酶活由6 736 U/L提高至8 470 U/L；而藜芦醇抑制产酶，愈创木酚对产酶无明显影响。

图3 不同金属离子添加对SO3产漆酶的影响Fig.3 Effect of different metallic ion

图4 不同诱导剂对SO3产漆酶的影响Fig.4 Effect of different inducer

2.1.5 培养基的正交实验结果

从表2和表3的正交实验结果和方差分析可知，因素A(酵母粉)的第二个水平最佳，因素B(麦麸)的第三个水平最佳，因素C(葡萄糖)和D(磷酸二氢铵)最佳水平分别是第一和第二。因此最优培养基组分为A2B3C1D2，即酵母粉0.5%、麦麸2.5%、葡萄糖0.5%、磷酸二氢铵0.5%。极差(R)反映了不同因素对酶活影响的程度，其主次顺序为A(酵母粉)>D(磷酸二氢铵)>B(麦麸)>C(葡萄糖)。通过此培养基进一步优化后，木蹄层孔菌(Fomesfomentarius)SO3漆酶活性达到10 863 U/L。

2.2 漆酶部分酶学特性研究

2.2.1 SO3菌漆酶的最适反应温度

在预试验基础上，设定在50 ℃条件下测定的SO3漆酶活性为100%，20到80 ℃温度区间内测定的反应液酶活分别为60.7%、79.6%、88.4%、100%、91%、98%、74%(图5)。

2.2.2 SO3菌漆酶的热稳定性

SO3漆酶反应液继续保温10 min后，对比相同温度下起始酶活， 计算剩余酶活百分比，结果表明，40 ℃时稳定性最好(图6)。

表2 木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)SO3 L9(34)产酶条件正交实验结果

表3 方差分析表

图5 SO3漆酶最适反应温度Fig.5 The optimum reaction temperature of SO3

图6 SO3漆酶热稳定性Fig.6 Thermal stability of SO3

2.2.3 SO3菌漆酶的最适反应pH

实验结果表明，pH为2.0到3.0时所测定的酶活相对较高，pH为2.0时酶活为1 295 U/L，pH4.0时酶活为897 U/L，pH为6.0以上时所测酶活为0(图7)。

图7 SO3漆酶最适反应pHFig.7 Effect of optimal pH on SO3 laccase

2.2.4 SO3菌漆酶pH稳定性

实验结果表明，漆酶在40 ℃保温24 h，pH4.0～5.0时酶活较稳定，pH3.0时相对酶活为42.1%，pH4.0时为73.6%，pH5.0时，酶活达到最大为97.8%，随着pH值的升高酶活逐渐降低，超过pH6.0时残留酶活为0(图8)。

图8 SO3漆酶的pH稳定性Fig.8 Effect of pH on SO3 laccase stability

2.2.5 不同金属离子对漆酶稳定性的影响

结果表明，Mn2+和Zn2+对酶稳定性有一定的促进作用，其中在含有Zn2+的pH4.0的NaAc-HAc缓冲液反应体系中，所测酶活为955 U/L，为对照的102%，Mg2+、Cu2+、Ba2+酶稳定影响不大；Co2+、Cd2+、Cr2+和Pb2+对酶的稳定性具有明显的破坏作用，其中加入Co2+时酶活为28%，Cd2+为47%，Pb2+为54%；而Fe2+对漆酶活性完全抑制(图9)。

2.3 SO3漆酶蛋白性质研究

2.3.1 不同纯化步骤的SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE电泳结果如图10所示，发酵培养基中含有多种蛋白及多肽，发酵液上清在61 KD左右有较明显的蛋白带，经过离子交换层析后基本呈单一条带，经过凝胶过滤层析后，SDS-PAGE电泳显示只有一条蛋白带。通过一系列的蛋白分离纯化实验，获得的漆酶已经达到了电泳纯级。应用Bio-RAD quantity one分析软件[17]，根据标准蛋白相对分子量，得出木蹄层孔菌漆酶相对分子量约为61.5 KD。

图9 不同金属离子对SO3漆酶稳定性的影响Fig.9 Effect of different metal ion on SO3

图10 菌株不同纯化步骤的SDS-PAGE图Fig.10 SDS-PAGE of purification steps of F.fomentarius 注：M.蛋白相对分子量标样；1.硫酸铵盐析(60%)；2.离子交换层析；3.硫酸铵盐析(80%)；4.凝胶过滤层析。Note:M.protein markers;1.Ammonium sulfate salting-out(60%);2.Ion-exchang chromatography;3.Ammonium sulfate salting-out(80%);4.Gel filtration chromatography.

2.3.2 木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶蛋白质双向电泳及等电点

分别将以木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3发酵产酶高峰时的菌体及发酵液蛋白样品用pH为3.0-10范围的IPG非线性胶条进行等点聚焦，然后用12%的SDS-PAGE凝胶进行第二向分离。结果表明，菌体蛋白检测出较多蛋白质点，而发酵液蛋白点则主要在同一等电点区域，通过Bio-Rad PDQuest 2-D Analysis software软件分析，酶蛋白pI为4.1，将菌体及发酵液表达量高的同一蛋白质点切下进行质谱分析。

图11 木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3菌体及发酵液的蛋白质双向电泳Fig.11 Protein two-dimensional electrophoresis注：a.菌体；b.发酵液。Note:a.Ultrasonic disintegration sample cell;b.Upernatant of fermentation liquor.

2.3.3 木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶质谱分析

对主要表达蛋白进行MALDI TOF/TOF质谱分析(图11)，利用GPS Explor软件进行分析，MASCOT检索NCBI Nr蛋白质数据库，成功鉴定1个蛋白点(蛋白质得分>50，可信度>90)(表4)，鉴定的蛋白为LaccaseE(Trametessp.420)，其肽脂纹图谱中有8条序列均与LaccaseE蛋白匹配。

表4 木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶质谱分析中基本信息和匹配的肽段序列

3 讨论与结论

漆酶是一种分布广泛的多酚氧化酶，在食品、能源和环保等领域具有重要的应用价值。木蹄层孔菌可以合成分泌包括漆酶在内的多种木质纤维素降解酶，这些酶的活性会随着发酵工艺的不同而不同，所以对产酶发酵工艺进行优化，对于提高漆酶产量和酶活具有重要意义。漆酶的合成和分泌受到营养水平、培养条件、生长阶段以及培养基中诱导剂的严格调控，木质素或木质素相关的芳香类化合物、N源和C源也能调节漆酶的合成[18]。

微生物酶类分为组成酶和诱导酶。组成酶是指微生物无论在任何培养基中，总是适量地存在的一些酶类；诱导酶是依赖于酶作用底物或底物结构类似物的存在而合成的酶类[19]。漆酶胞外组成酶产量较低，当添加与木质素或木质素衍生物相关的芳烃类和酚类诱导物时，能显著提高漆酶酶活。Hao[20]研究发现，ABTS、甲苯胺和对苯二酚对新疆野生巴尔喀什蘑菇产漆酶有明显的促进作用，而咖啡酸、没食子酸、邻苯二酚、2，6-二甲氧基酿和愈创木酸对产酶诱导不明显。Li等[21]利用Cu2+和麦麸作为共同诱导剂使白腐菌产漆酶活性达到51004 U/L。木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶对不同种类、不同浓度的金属离子以及诱导剂的响应不尽相同，表明其具有较复杂的生理功能及调控机制，结果可为进一步阐明漆酶作用机制提供基础。

培养基是发酵工艺优化中的重要因素，本试验在基础产酶培养基的基础上，对碳氮源进行了进一步的筛选，并利用正交试验对筛选出的碳氮源进行组合，最终确定0.5%酵母粉、2.5%麦麸、0.5%葡萄糖、0.5%磷酸二氢铵的最优组合，此时漆酶活性可达10 863 U/L。Chen等[22]对产漆酶黄孢原毛平革菌的培养基进行筛选优化，最终确定乳糖和酵母粉为最佳碳、氮源，使该菌的产酶能力提高了4.7倍。 Liu等[23]采用20 g/L 蔗糖、2 g/L酵母膏、3.2 g/L K2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、3 mg/L SDS、6 mmol/L Cu2+、pH7.0的优化培养基，使有柄树舌灵芝菌产漆酶活性达到496.18 U/mL，是优化前的12.2倍。

双向电泳的主要分泌蛋白质谱分析结果表明，木蹄层孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶胞外分泌蛋白类型主要为LaccaseE(Trametessp.420)，获得了该蛋白质的10个漆酶氨基酸序列片段，为后续差异基因表达序列的获得提供了依据。