复方精油香气抗抑郁作用研究

王 莹，陶凤瑛，崔东红，刘玉敏，吴亚妮

1上海交通大学设计学院；2上海交通大学医学院附属精神卫生中心；3上海交通大学分析测试中心,上海 200240

精神疾病是世界公共卫生领域的一项重大难题，据估计2020年抑郁症可能发展成为世界第二大危害人体健康的疾病[1]。作为一种情感性障碍的临床类型精神疾病，抑郁症具体表现为睡眠困难、兴趣丧失、食欲降低、情绪不稳定等[2,3]。近几年研究发现，抑郁症与神经递质的改变[4]，下丘脑-垂体-肾上腺轴[5]以及谷氨酰胺神经转录系统的紊乱[6]相关。西药治疗作为临床治疗抑郁症的常用方式，存在有一定毒副作用和药物依赖性的问题。芳香嗅吸疗法因操作方便、对纾解不良情绪具有良好的作用而在生活中被广泛使用，有望逐步成为对传统医疗手段的有益补充。

目前关于抑郁症的干预研究主要集中在中、西医药物的应用，少有关于抗抑郁复方精油香气应用于临床的作用分析。本文基于气相色谱高通量飞行质谱(GC-TOF/MS)技术，分析抑郁症患者闻香前后尿液中差异代谢物的变化，初步探讨复方精油香气抗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

抗抑郁复方精油，由上海交通大学设计学院芳香疗法研究室提供，批号为20150316，主要由薰衣草、苦橙花、大西洋雪松、佛手柑、依兰依兰、檀香木、玫瑰等复配而成。尿素酶，生工生物工程；BSFTA(硅烷化试剂)、2-氯苯丙氨酸、甲醇/氯仿(3∶1)、甲氧胺吡啶溶液均使用上海交通大学分析测试中心试剂。

1.2 基于GC-MS技术测定抗抑郁复方精油精油成分

1.2.1 GC-MS仪器条件

7890B-5977B气相色谱质谱联用仪；色谱柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；温程序：初始柱温50 ℃，加热1 min后以3 ℃/min加热至110 ℃，再以5 ℃/min加热至220 ℃，保持5 min；载气为高纯度氦气。质谱仪条件：电离方式设为E1，电离电压：70 eV；离子源温度200 ℃；采用全扫描方式扫瞄，扫描范围设为10～600m/z。

1.2.2 数据处理

结合GC/MS标准质谱数据库进行成分的定性分析，按照标准谱图与色谱峰的质谱碎片图对照，人工检索确定每一种成分的化学结构；定量分析是根据检测到的色谱峰峰面积归一化法，计算各成分间的相对含量。

1.3 人体尿液样本代谢物研究

1.3.1 实验分组

志愿者尿液样本均来自于上海交通大学医学院附属精神卫生中心。其中抑郁症患者44人，根据DSM-IV(美国精神障碍的诊断与统计手册)确诊，抑郁症状至少一个月。所有患者自愿接受实验并签署知情同意书，均无香气或香料物质过敏史及心肝肾等疾病。健康组为同期医院体检的健康人群，体检身体健康，无临床症状表现。具体情况如表1所示，3组性别、年龄、体重差异均无统计学意义。

表1 志愿者生理指标详表

注：P>0.05，证明差异无统计学意义。

Note:P:analysis of variance shows thatP>0.05,which proves that the difference is not statistically significant.

1.3.2 实验设计

抑郁患者闻香组每天在下午2时集中在治疗室内嗅闻香气45 min；抑郁患者不闻香组及健康组分别在下午2时集中在治疗室休息45 min。分别在第0天、第10天、第20天对3组研究对象进行尿液的采集与处理。

1.3.3 GC-TOF/MS质谱检测程序

Agilent 6890N色谱仪；色谱柱：DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；升温程序：80 ℃加热两分钟，以10 ℃/min加热至180 ℃，再以5 ℃/min加热至240 ℃，最后以25 ℃/min加热至290 ℃，加热9 min;载气流速(恒流)1 mL/min；载气：氮气。质谱仪的电离方式设为E1，电离电压：70 eV；进样口温度270 ℃；接口温度260 ℃；离子源温度200 ℃；采用全扫描方式扫瞄，扫描范围设为30～600m/z，20张/s TOF质谱图采集。

1.3.4 数据处理及分析

将获得的原始数据导入Marker Lynx软件包，生成含有保留时间、质荷比、峰面积的三维矩阵。将处理后生成的文件导入 SIMCA-P 14.1 软件中进行分析，选择VIP>1的物质作为主要潜在代谢标志物。根据所对应的保留时间和质荷比(m/z)，初步确认潜在标志物的结构并确定物质。最后通MetaboAnalyst 4.0生物学数据库进行代谢通路的分析。

图1 抗抑郁复方精油GC/MS总离子流图Fig.1 TIC of compound essential oil derived by GC/MS

2 结果

2.1 复方精油成分结果分析

抗抑郁复方精油的总离子电流图见图1，精油的分析结果见表2，共鉴定出41种化学物质，占挥发油总含量的98.638%。其中含量最高的是右旋柠檬烯(7.35%)，其次是香茅醇(9.37%)、乙酸芳樟酯(6.92%)、芳樟醇(6.71%)等。

表2 抗抑郁复方精油主要成分和相对含量

续表2(Continued Tab.2)

序号No.化学成分Chemical composition保留时间tR(min)相对含量Relative content (%)39肉豆蔻酸异丙酯 Isopropyl myristate28.643 81.8940脱氢枞酸甲酯 Methyl dehydroabietate33.779 61.1741松香酸甲酯 Methyl abietate34.226 40.26

2.2 尿液GC-TOF/MS图谱分析

图2为志愿者尿液的TIC图，从图中可以看出在闻香前后一些谱峰出现了较为明显的差异，图谱包含了大量参与氨基酸代谢与牛磺酸代谢的各类代谢物的信息。

图2 志愿者尿液GC-TOF/MS总离子流图Fig.2 TIC of urine samples from volunteer derived by GC-TOF/MS

2.3 模式识别与判别分析

2.3.1 主成分分析得分图

对数据进行模型拟合分析，PCA(主成分分析)如图3-图4所示。图3为正常组和抑郁患者不闻香组的对比结果，由于个体差异等原因，出现了离群样本点，模型累积解释率R2X=0.658，Q2=0.434，因此当前 PCA模型能够解释两组样本之间的代谢差异。图4为正常组和抑郁患者闻香组的对比结果。模型累积解释率R2X =0.728，Q2=0.435，建立的PCA模型较为可靠。

2.3.2 OPLS-DA(正交偏最小二乘判别) 模式识别

图5为正常组与抑郁患者不闻香组的OPLS-DA图，说明在不闻香的情况下，抑郁患者的情况没有得到改善。R2X= 0.590，R2Y= 0.190，Q2=0.684，建立的数学模型可靠。

图3 正常组与抑郁患者不闻香0天、10天、20天的PCA得分图Fig.3 PCA scores plot of normal group and depression group without aroma for 0,10 and 20 days

图4 正常组与抑郁患者闻香0天、10天、20天的PCA得分图Fig.4 PCA scores plot of normal group and depression group with aroma for 0,10 and 20 days

图5 正常组与抑郁患者不闻香0天、10天、20天的OPLS-DA得分图Fig.5 OPLS-DA scores plot of normal group and depression group without aroma for 0,10 and 20 days

正常组与抑郁闻香组的OPLS-DA得分如图6。抑郁症患者组闻香干预后有倾向于正常组的趋势，说明抗抑郁复方精油对患者的代谢物调节有一定的作用。R2X= 0.622，R2Y= 0.688，Q2=0.60，模型的稳定性和预测率较高。

图6 正常组与抑郁患者闻香0天、10天、20天的OPLS-DA得分图Fig.6 OPLS-DA scores plot of normal group and depression group with aroma for 0,10 and 20 days

为进一步了解精油香气干预前后志愿者代谢物的差异变化及复方精油的作用机制，采用OPLS-DA对抑郁患者闻香0天(T0)与正常组(N)、抑郁患者闻香10天(T1)、20天(T2)进行分析，并得到对应的S-Plot载荷图，如图7～图12所示。结果表明T0与N、T1、T2均分离比较明显，选取VIP>1的物质进行t检验(P<0.05)，确定生物标记物。

图7 T0与N 的OPLS-DA得分图Fig.7 OPLS-DA scores plot of T0 and N

图8 T0与N的S-plot图Fig.8 S-plot of T0 and N

图9 T0与T1的OPLS-DA得分图Fig.9 OPLS-DA scores plot of T0 and T1

图10 T0与T1的S-plot图Fig.10 S-plot of T0 and T1

图11 T0与T2 的OPLS-DA得分图Fig.11 OPLS-DA scores plot of T0 and T2

图12 T0与T2 的S-plot图Fig.12 S-plot of T0 and T2

2.4 生物标记物鉴定

结合数据库检索对T0与N、T1、T2的差异代谢物进行鉴定并分析含量变化。结果发现在尿液样本中，T0与N比较共筛选到6种化合物，T0与T1、T2对比均筛选到4种化合物。代谢物主要为氨基酸类，鉴定出的代谢标志物如表3～表5所示，其中闻香前后，有5个差异代谢物呈现上调趋势，1个下调。

表3 T0与N 代谢标志物鉴定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多维分析得到的代谢物重要性参数；Change Trend 表示N与T0代谢物的变化趋势。↑表示N中代谢物质含量相对T0时增加，↓表示N中代谢物质含量相对T0时减少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of N and T0metabolites.↑ indicates that the content of metabolic substances in N increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in N decreases relative to T0.

表4 T0与T1 代谢标志物鉴定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多维分析得到的代谢物重要性参数；Change Trend 表示T1与T0代谢物的变化趋势。↑表示T1中代谢物质含量相对T0时增加，↓表示T1中代谢物质含量相对T0时减少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of T1and T0metabolites.↑indicates that the content of metabolic substances in T1increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in T1decreases relative to T0.

表5 T0与T2 代谢标志物鉴定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多维分析得到的代谢物重要性参数；Change Trend 表示T2与T0代谢物的变化趋势。↑表示T2中代谢物质含量相对T0时增加，↓表示T2中代谢物质含量相对T0时减少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of T1and T0metabolites.↑indicates that the content of metabolic substances in T2increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in T2decreases relative to T0.

2.5 代谢通路筛选

将表4和表5鉴定出的标记物，通过Metaboanalyst的通路分析模块对代谢通路进行鉴定，本文选择P<0.05，Impact>0.1作为抗抑郁复方精油干预的主要代谢通路，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及牛磺酸和亚牛磺酸代谢(图13和14，表6和7)。

图13 T0与T1代谢通路分析 Fig.13 Metabolic pathway analysis of T0 and T1注：A.牛磺酸和亚牛磺酸代谢；B.甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。Note:A.Taurine and hypotaurine metabolism;B.Glycine,serine and threonine metabolism.

图14 T0与T2代谢通路分析 Fig.14 Metabolic pathway analysis of T0 and T2注：A.甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；B.牛磺酸代谢。Note:A.Glycine,serine and threonine metabolism;B.Taurine and hypotaurine metabolism.

3 结论

芳香植物精油的香气成分对情绪调节有良好的效果。Lima等[7]的研究表明D-柠檬烯在鼻腔与脑的传递途径效率较高且在舒缓精神压力方面有较好效应。研究发现乙酸芳樟酯和芳樟醇在缓解精神抑郁症状方面具有显著作用[8]。本文通过对尿液样本深入分析发现抗抑郁复方精油的调节代谢途径主要涉及以下两个方面，说明植物精油香气对神经系统功能的正常发挥有一定的调节作用。

表6 T0与T1代谢通路分析结果

表7 T0与T2代谢通路分析结果

3.1 氨基酸代谢调节

氨基酸与生物生命活动紧密相关。甘氨酸是人体内非必要氨基酸，是中枢神经系统中的抑制性神经递质[9]，对控制神经元兴奋方面有重要作用，当其含量过多会增强NMDA受体的激动生理效应，而NMDA受体的过度激活被认为是抑郁症发病的原因之一[10,11]；丝氨酸是膳食蛋白的组成部分，是一种重要的氨基酸，可用作磷脂中碱的前体，丝氨酸本身和丝氨酸转化为甘氨酸调节NMDA受体均可以影响中枢系统。

3.2 牛磺酸代谢调节

牛磺酸存在于人体的大脑、心脏和肾脏中，具有很多生物学调节功能，如作为神经递质、细胞膜的稳定剂和促进钙离子转运等[12,13]。缺少牛磺酸最显著的症状是精神抑郁，有精神恍惚、睡眠障碍等表现。牛磺酸的含量影响了(-氨基丁酸受体及甘氨酸受体，临床发现在几乎所有抑郁症患者都存在牛磺酸含量不足的现象[14,15]。