流动相pH值对离子型物质分离的影响

刘珍 王彦 闫超

（上海交通大学药学院 上海 200240）

在多物质的液相色谱分离过程中，常常包含有酸碱离子型化合物，除了通过筛选色谱柱、更改流动相种类和比例等方式外，调节流动相的pH值常常是改善该类物质分离度的有效手段。本文从理论上进行分析，并且辅以具体的实例，阐述了这一行为在色谱分离中的应用和注意事项。

1.流动相pH值对分离的影响

流动相的pH值对酸碱离子型的物质影响最为显著，其保留与pH值的关系有详细的理论分析[1]。简单来说，酸性物质在低pH条件下呈分子态，保留较强；在高pH条件下呈离子态，保留较弱。碱性物质在高pH条件下呈分子态，保留较强；在低pH条件下呈离子态，保留较弱。

对于中性物质，保留时间一般不受pH值影响，重现性相对比较好；对于离子型物质，如上所述，在一定的pH值范围内，保留时间受pH值影响很明显，特别是临近pKa附近，微小的pH值波动就可能使保留时间出现较大的变化，导致方法的重现性较差。

图1 不同pH值下离子型物质的分子-离子态转化和保留时间的变化

离子型物质的离子化过程如下：

上图从微观和宏观上很好的描述了这种现象[2]。

pH≤4时，酸性物质HA主要以分子态[HA]形式存在，在色谱图上表现为较强的保留（10min）；碱性物质B以离子态的[BH+]形式存在，色谱图上表现为几乎无保留（1min）。

pH=5时，酸性物质HA呈50%离子化状态，在色谱图上表现为保留减弱（6min）；碱性物质B在此pH下仍旧以离子态[BH+]形式存在，色谱图上仍无保留。

pH=7时，酸性物质HA和碱性物质B均主要以离子态[A-]和[BH+]形式存在，表现在色谱图上为两者均无保留（重合，1min）。

pH=9时，酸性物质HA呈完全离子化状态，色谱图上无保留；碱性物质B呈50%离子化状态，在色谱图上表现为保留增强（6min）。

pH≥10时，酸性物质HA仍呈完全离子化状态，色谱图上无保留；碱性物质B主要以分子态[B]形式存在，在色谱图上表现为较强的保留（10min）。

2.合理认识流动相pH值在分离中的作用

pKa是一把双刃剑。我们一方面希望流动相体系的pH值远离被分离物质的pKa来获得稳定的保留时间，但对于十余个物质的混合溶液，常常没法避开所有物质的pKa；从另一个方面来说，正因为有pKa的存在，当酸、碱物质的流动相体系处于pKa附近时，保留时间可以很容易被精细调整，使得分离的可能性大大增加。

在实际的方法开发过程中，我们通过各个待分离物质的化学结构式就能大致判断哪些物质是pH值敏感型。但这些pH值敏感型物质在哪一个pH值范围段内敏感？敏感到什么程度？峰型如何？这些数据往往需要通过实验来系统的了解，我们可以在大范围的pH值内（如pH值=2，4，6，8，10）进行初筛，然后根据结果进行小范围的pH微调。

需要注意的是，上述分子-离子态转化对离子型物质的保留时间有非常显著的影响，但不同pH环境只是影响该类物质保留的因素之一。对于结构较复杂的离子型物质，对保留行为起主要作用的可能是该物质中其他结构与固定相的作用力，比如芳香族离子型分析物在苯基柱上，起主要作用的可能是π-π作用，不同pH值下分子-离子态对保留时间的敏感程度可能相对较低。因此，进行pH值的筛选，应尽可能减少其他作用力，减少各影响因素。建议在封端的未进行键合基团改造的单纯C18键合相的色谱柱上进行，其色谱行为更加可控。在各因素未能充分研究透彻的情况下，单因素考察是一个非常简单有效的方式，可以提供规律性更强的信息。

3.pH值调节在色谱分离中的应用

在一种降压药中8个杂质与主成份的分离试验。在8个待研究的杂质中，有2个碱（杂质A和F），1个酸（杂质C），理论上来说，流动相的pH值能显著影响这些物质的保留。

选用pH值耐受范围为1-12的Waters XBridge C18色谱柱，磷酸盐-乙腈体系梯度洗脱。

图2 8个杂质在流动相pH4.0-pH10.0的色谱图

上述杂质中，杂质A和杂质F是带有-NH2结构的碱性物质，在低pH下呈离子态，保留较弱，随pH升高而保留增强；杂质C是带-COOH结构的可电离的复杂物质，在高pH下呈离子态，保留较弱，随pH降低而保留增强。

上图中可以明显看出这些酸碱杂质随流动相pH变化导致保留时间变化的情况，可以收集到如下信息：

（1）碱性杂质F在pH6.0～pH8.0对流动性pH值最敏感。

（2）碱性杂质A在pH6.0以下时，对流动相pH较为敏感，pH在6.0以上，保留时间趋于稳定。

（3）酸性杂质C在pH值6.0以下时，对流动相的pH较为敏感；且在pH6.0以下时，可能因其分子态/离子态同时存在而导致峰形拖尾现象；当pH值在6.0以上时，电离较为完全，保留时间基本固定。

（4）pH8.0～10.0间，杂质F和C分离度较小，且位置互换，应尽量避免此段。

初筛4个pH后，考虑到杂质C的峰形，且杂质F在杂质A和C的空间要大于杂质C和G的空间，最终细筛pH值为7.7，各杂质的分离度和峰型良好。

4.讨论

离子型物质的分离还有其他的选择，如使用离子对试剂增强保留时间和达到分离的目的。但离子对分析方法本身存在很多局限，主要是效率低下，无法兼容质谱，以及会对色谱柱的填料造成难以逆转的保留行为改变，这在实际应用过程中会带来诸多不便。此外，通过特殊的色谱柱，如离子交换色谱柱、Hillc等实现离子型物质的保留和分离，也是一种积极的尝试。