三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性研究

汤红，张鸿，张定平，龙月娟※，毛忠顺

(1.文山学院环境与资源学院，云南 文山 663099；2.文山学院三七学院，云南 文山 663099；3.文山学院三七研究院，云南 文山 663099)

三七黑斑病是三七的主要叶部病害之一，在三七产区发生普遍，通常发病率为25%～35%，防治不当可高达90%[1]，每年5 月、7～9 月是病害严重暴发的高峰期，当日平均气温达18 ℃以上，空气相对湿度达65%以上，连续小雨2～3 d 或日降雨量达15 mm 以上时，常暴发黑斑病，并且发病率随着降雨次数和降雨量的增加而上升[2]。三七黑斑病病原主要通过侵染三七叶片部位引发病害，其茎、花轴及果柄的幼嫩部位均可受害，对三七的产量和质量造成严重影响。目前，对三七黑斑病主要采用化学防治，但对杀菌剂的过分依赖和用量的不断增加，较易造成三七农药残留超标，品质下降，也使得该病害对一些常用杀菌剂的敏感性下降。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 50 个供试菌株分离自云南省砚山、石林、西双版纳和丘北等不同三七种植基地且具有典型症状的三七黑斑病病样，经鉴定为三七黑斑病菌Alternaria panax Whetz。

1.1.2 供试药剂 烯唑醇原药由云南农业大学植物病理学重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性测定 参照徐建强等[11]方法进行，将供试菌株在无菌PDA 平板上20 ℃培养 7 d，用打孔器（=5 mm）在菌落边缘打取菌饼，设置含药 PDA 处理分别为 0.01、0.10、0.50、1.00、5.00g/mL 的烯唑醇系列浓度处理，同时以不含药剂的无菌PDA平板菌饼为对照处理，将打取的菌饼分别接入含药培养基及对照培养基的中央，每处理重复5次，每皿接1 个菌饼，置于20 ℃光照培养7 d，采用十字交叉法测量菌落直径。按以下公式计算菌丝在不同浓度药剂处理下的菌丝生长抑制率（R）。

1.2.2 敏感性分布图绘制及敏感基线的确定 根据“1.2.1”中的敏感性测定结果，将其从低到高依次分为几个不同区间，统计每个区间菌株EC50 值频数，计算出其占整个群体的频率（%），以菌株EC50 值为x 轴、相应敏感性频率为y 轴，绘制三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性频率分布图。根据建立的敏感性频率分布图确定敏感基线。

1.2.3 抗性水平测定 利用所建立的相对敏感基线，求出三七黑斑病菌对烯唑醇的抗性指数和抗性菌株频率。抗性指数≤3 为敏感菌株（S）；3 ＜抗性指数≤10为低抗菌株（LR）；10＜抗性指数≤100为中抗菌株（MR）；抗性指数＞100 为高抗菌株（HR）[12]。

1.2.4 数据处理 将“1.2.1”敏感性测定中抑制率转化为几率值，利用DPS v7.05 数据分析软件计算出烯唑醇抑制菌丝生长的毒力回归方程、相关系数和烯唑醇对三七黑斑病菌的EC50（g/mL）；利用 SPSS 22.0 软件对“1.2.2”中所得敏感性频率分布进行Shapiro-Wilk正态分布检验；采用SPSS 22.0 软件对计算出的菌株EC50 值进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 三七黑斑病病菌对烯唑醇的敏感性及敏感基线的建立

采用菌丝生长速率法测定所获50 个三七黑斑病菌株对烯唑醇的敏感性，结果显示50 个三七黑斑病菌对烯唑醇的EC50 值为0.1739～6.6707/mL，平均EC50值为（1.784 5±1.195 4）g/mL，最大值是最小值的38.3倍。根据所测50 个三七黑斑病菌的EC50 值，设置0.5g/mL 的截距将其分成10 个区间，统计每个区间的菌株数和占总群体频率，建立三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性频率分布图（图1）。利用SPSS 对其进行Shapiro-Wilk 正态性检验，结果显示其敏感性频率分布不符合正态性分布（W=0.865，P ＜0.05），表明三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性产生一定分化，出现敏感性降低的亚群体。

供试菌株对烯唑醇的敏感性已出现一定的分化，但仍有82%的菌株（41 株）敏感性频率分布呈连续单峰曲线（图2），将这41 株菌株用SPSS进行Shapiro-Wilk正态性检验，结果显示该群体对烯唑醇的敏感性频率分布呈近似正态分布（W=0.951，P=0.076 ＞ 0.05），其EC50 平均值为（1.354 2 ± 0.652 9）g/mL，故可将其平均值初步作为三七黑斑病病菌对烯唑醇的相对敏感基线。

2.2 不同地区三七黑斑病菌菌株对烯唑醇的敏感性差异

不同地区来源的三七黑斑病菌株对烯唑醇的敏感性不同（表1），石林地区菌株的EC50值为0.173 9～6.670 7g/mL，敏感性差异倍数最大，达38.4 倍，平均EC50 最高，为 2.417 4g/mL，表现为最不敏感；其次是丘北地区，菌株EC50 值为0.256 5～2.734 3g/mL，敏感性差异倍数约为10.7 倍；西双版纳地区菌株的EC50值为0.543 4～3.326 3g/mL，敏感性差异倍数约为6.1倍；砚山地区菌株的EC50 值为0.6073～3.6299g/mL，敏感性差异倍数最小，为6.0倍，平均EC50最低，为1.3050g/mL，表现为最敏感。其中，来自石林的菌株HS0（80.1739g/mL）对烯唑醇的敏感性最高（图3A），而同样来自石林的菌株HS04（6.670 7g/mL）对烯唑醇的敏感性则最低（图3B），说明相同地区的菌株敏感性也存在一定差异。仅在石林地区检测出对烯唑醇表现为低抗的菌株，其余地区菌株对烯唑醇均表现为敏感。

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2.3 不同地区来源菌株对烯唑醇敏感性水平的系统聚类分析

从云南省4 个地区每地区随机抽取8 株三七黑斑病菌株，共32 株，对其EC50值进行聚类分析，聚类系谱图显示（图4），烯唑醇32 个菌株的EC50 值可分为3个聚类组，每组分别包含20、8、4 个菌株。第一聚类组中出现菌株数较多，包含4 个地区菌株；第二聚类组包含除砚山以外其余3 个地区菌株；第三聚类组中包含除西双版纳以外其余3 个地区菌株。表明三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性差异与菌株来源具有一定的相关性。

图4 不同地理来源菌株对烯唑醇敏感性水平的系统聚类分析Fig.4 Hierarchical cluster analysis of susceptibility levels of strains from different geographical sources to diniconazole

2.4 菌株对烯唑醇的抗性水平

50 个菌株中有48 个敏感菌株，占总菌株的96%，为优势群体；2 个低抗菌株，占总菌株的4%；无中抗菌株和高抗菌株出现。各菌株对烯唑醇的抗性指数在0.13～4.93，平均抗性指数为1.31。对烯唑醇的抗药性以砚山地区菌株最弱，抗性指数为0.96，石林地区菌株对烯唑醇的抗性指数最高，为1.78。4 个地区的三七黑斑病菌对烯唑醇的抗药性表现为砚山＜丘北＜西双版纳＜石林（表2）。

表2 云南省不同地区三七黑斑病菌对烯唑醇的抗性Table 2 Resistance for to diniconazole in different regions in Yunnan

3 讨论

三七作为云南省最具特色的优势生物资源之一，种植面积不断增加，由于其对生长环境的特殊要求，较易受到不同病害的影响。三七黑斑病是三七主要病害之一，近年在各三七产区持续爆发，造成三七产量和品质的不断下降。目前，对三七黑斑病的防治主要以化学药剂为主。三唑类杀菌剂能有效抑制子囊菌亚门、担子菌亚门及半知菌亚门的病原菌生长，对番茄叶霉病菌[13]、花生黑腐病菌[14]、枸杞炭疽病菌[15]、烟草赤星病菌[16]等多种真菌性病害防治效果较好。烯唑醇作为使用广泛的三唑类杀菌剂，具有效果强、持续时间长和内吸输导性好等特点，能有效防治白粉病[17]、纹枯病[18]和杧果流胶病[19]等多种真菌性病害的发生，但其作用位点相对单一，包媛媛等[7]研究发现烯唑醇对抑制病原菌菌丝生长有较好效果，但对病原菌孢子的生长抑制效果较差。随着用药时间和剂量的不断增加，以及对烯唑醇的连续单独使用，已发现部分植物病害对烯唑醇敏感性下降，如甘林等[9]在进行福建玉米小斑病菌对杀菌剂的毒力测定时就发现病菌对烯唑醇敏感性下降；徐建强等[20]研究也发现在小麦纹枯病中出现对烯唑醇敏感性下降的亚群体。但一直以来尚无学者开展三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性的相关报道，该试验首次初步进行三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性测定，发现在三七黑斑病菌中同样出现对烯唑醇敏感性下降的亚群体。

本研究在室内初步测定三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性，大部分菌株对烯唑醇处于敏感水平，仅菌株HS04 和HS14 对烯唑醇表现为低抗，说明云南省三七黑斑病菌还没有对烯唑醇产生严重的抗药性，但抗性菌株的出现，表明使用烯唑醇对防治三七黑斑病仍存在一定的风险，而最终是否会影响烯唑醇的田间防治效果，还需要通过田间药剂防效试验进一步明确，后续应持续关注三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性水平。为延缓三七黑斑病菌对烯唑醇的抗性发展，建议在三七种植中避免对烯唑醇的重复施用，严格把控使用量，或将其同其他类药剂配合施用。为有效防治三七黑斑病，在生产上应尽量减少烯唑醇类药剂的单一、重复使用，严格控制其施用剂量和间隔时间，可将烯唑醇与不产生交互抗性的药剂相配合使用，减少其抗性风险。

4 结论

本研究采用菌丝生长速率法，测定了分离自云南省砚山、石林、西双版纳和丘北等不同三七种植基地的50 个三七黑斑病菌对烯唑醇的敏感性。三七黑斑病菌对烯唑醇的EC50 值为0.173 9～6.670 7g/mL，平均EC50 值为（1.784 5±1.195 4）g/mL，最大值是最小值的38.3 倍，以组成连续单峰频次82%以上菌株群体的 EC50 平均值（1.354 2 ± 0.652 9）g/mL 初步建立了三七黑斑病菌对烯唑醇的相对敏感基线。50 个三七黑斑病菌株中，有48 个敏感菌株，2 个低抗菌株，表明云南省三七黑斑病菌已有对烯唑醇产生抗药性的趋势。