食醋大曲功能微生物菌群与品质解析研究进展

黄 静，严唯玮，刘书亮,2,*，刘爱平，敖晓琳,2，王 瑞，杨 勇，杜大钊，陈福生

（1.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2.四川农业大学食品加工与安全研究所，四川 雅安 625014；3.四川保宁醋有限公司，四川 阆中 637400；4.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

食醋是一种传统的酸性调味品和保存剂，历史悠久，在人类生产生活中占据重要地位[1]。国内食醋以谷物醋为主，是采用谷物类为原料，以加入大曲的方式引入多种微生物和酶，通过复杂的发酵过程所制得的产品[2-3]。大曲是一种天然发酵剂，包含多种代谢活跃的微生物和酶，其主要是以大麦、小麦、麸皮和豌豆等为原料，按照一定的配方，经粉碎、加水调制后压制而成的曲块，在食醋和白酒的生产及产品风味形成过程中发挥重要作用[2,4-5]。目前，在食醋中发现的大多数风味物质来源于大曲中的微生物，并在发酵过程中产生[6]。

大曲的制作是我国古老的固态发酵技术，可追溯到3 000 年前，是我国劳动人民智慧的结晶，其在食醋酿造过程中作为糖化剂和发酵剂，是食醋发酵的灵魂所在[7]。食醋大曲借鉴了白酒大曲的生产技术，制作过程主要涉及3 个阶段[2]：1）原料研磨、混匀和成型；2）自然固态发酵；3）干燥和熟化。食醋大曲中菌系、物系、酶系相对复杂，且不同地方生产的大曲具有差异性，因此，对不同大曲中的功能微生物菌群及其品质进行解析对传统食醋大曲的商业化规模生产尤为重要[8]。本文聚焦于食醋大曲功能微生物菌群、品质影响因素、品质表征、大曲品质与食醋品质的关系及大曲品质改良等方面，以期为食醋大曲的生产研究及品质改善提供参考，促进大曲的标准化生产，推动食醋行业的发展。

1 食醋大曲功能微生物菌群

食醋大曲生产环境相对开放，制曲环境、原料及器具中的微生物都可能进入到大曲体系中，使其集聚了食醋酿造所需的大部分微生物。开放式环境可以富集较多的微生物在大曲中，这些微生物经过驯化分泌多种酶，并利用原料生成不同风味物质或其前体物质，有利于食醋良好风味的形成[9]；但同时大曲的生产易受到环境的制约和杂菌的污染，由此可能导致醋醅发生霉烂、恶臭，进而影响食醋品质。对不同食醋大曲的功能微生物菌群进行分析，既是对污染菌进行溯源，也是对有益微生物及其代谢产物或发酵性能进行解析。建立不同类型食醋大曲的功能菌种库，对于食醋大曲及食醋品质的提升具有积极作用。

1.1 食醋大曲微生物菌群结构

我国利用大曲酿造白酒和食醋的历史悠久，但对其中微生物的研究却始于1930年[10]。对食醋大曲中菌群演替和多样性的探究是了解传统食醋发酵技术机制的重要途径之一，但目前难以通过单一的培养方法对其全面反映[11-12]。随着分子生物学技术的迅速发展，食醋大曲微生物菌群结构研究多采用分子生物学技术进行[13-15]。部分食醋大曲微生物菌群结构研究结果如表1所示。

不同食醋大曲微生物菌群结构具有较大差异，且在不同发酵时期处于动态变化。目前关于食醋大曲微生物菌群结构的研究为学者提供了一些新的研究思路。例如，针对大曲的整个发酵过程及不同醅层探明其变化；对食醋酿造过程中的菌群变化进行探究，以表征大曲与后续食醋酿造过程菌群结构的差异，剖析其关联性；对不同类型大曲菌群结构进行对比分析等。目前对于食醋大曲的研究还鲜有涉及菌群的季节性差异，可借鉴白酒大曲的研究思路进行相关探索，为提升食醋大曲及食醋品质提供数据支持[20-21]。

1 部分食醋大曲中微生物菌群结构的研究概况Table 1 Overview of microbial community structure in some vinegar Daqu

1.2 食醋大曲功能微生物的种类

对于食醋大曲功能微生物菌群的研究不仅限于菌群结构，近年来，由于不同类型大曲中功能微生物存在差异，以及出于规避某些优良菌种在环境胁迫下可能会被逐渐淘汰的风险，建立不同食醋大曲功能微生物菌种库及菌种的应用也成为研究热点。大曲中的某些功能微生物于大曲意义重大，但仍对与不同大曲复杂制造技术相关的特定微生物知之甚少[22]。目前仅有极少部分大曲分离和应用了功能菌种，其他类型大曲还需进一步采用传统分离方法进行探究。食醋大曲的微生物种类主要包括霉菌、酵母、细菌和少量的放线菌[23]。

1.2.1 食醋大曲中的霉菌及酶系

食醋大曲中的霉菌主要包括曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）、红曲霉（Monascus）等。在大曲中培菌的目的之一是利用其中的霉菌产酶，从而进行生化反应[24]。大曲中的酶主要有液化酶、糖化酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和脂肪酶等。大曲、霉菌、酶系三者联系紧密。目前对于大曲中霉菌及酶系研究较多的是白酒大曲，对食醋大曲的研究较少。霉菌所分泌的酶类对大曲品质有较大影响，筛选优良菌株并进行强化应用，有助于解决现行食醋行业普遍存在的大曲糖化力及出醋率低的问题。

1.2.2 食醋大曲中的酵母菌与风味物质

大曲中的酵母菌被誉为发酵动力，也可分泌多种酶类，在整个发酵阶段都具有重要作用。大曲中的酵母菌主要有假丝酵母（Candida）、酒精酵母和产酯酵母，不同类型大曲中酵母菌及其风味物质均存在差异[25]。部分食醋大曲中酵母菌及风味物质的研究结果如表2所示。

表2 部分食醋大曲中酵母菌及风味物质的研究概况Table 2 Overview of yeasts and flfl avor substances in some vinegar Daqu

酵母菌是食醋大曲中的主要功能微生物之一，对大曲中的酵母菌进行筛选及强化应用，有助于解决食醋实际生产中的一些问题，并促进食醋风味物质以及风味前体物质的形成。

1.2.3 食醋大曲中的芽孢杆菌

在大曲整个发酵过程中，特别是发酵后期，芽孢杆菌（Bacillus）是占主导地位的菌群之一，其可分泌多种水解酶，在液化和糖化过程中发挥重要作用，并且可通过三羧酸循环产生有机酸，有助于提升大曲乃至食醋的品质[28-29]。王进龙[29]研究山西老陈醋大曲中的芽孢杆菌，共分离得到包括解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、短小芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus）和巨大芽孢杆菌（B. megaterium）在内的26 株菌，同时得到产蛋白酶和淀粉酶活性较高的菌株。目前针对芽孢杆菌对食醋风味物质贡献的研究也是一大热点。

1.2.4 食醋大曲中的醋酸菌

醋酸菌是大曲产酸的主要来源之一，能氧化葡萄糖和乙醇生成乙酸，并进一步与醇反应生成乙酸酯[30]。对醋酸菌的种类、数量及发酵特性的解析有助于制曲和合理控制发酵进程。Du Xinjun等[31]从山西老陈醋大曲中分离到一株具有较高乙酸耐受性的葡糖醋杆菌（Gluconacetobactersp. SXCC-1），并对其进行全基因组测序分析。目前对于食醋发酵过程中醋酸菌的研究多集中于醋酸发酵阶段。对不同大曲中的醋酸菌进行筛选及特性研究，有利于为后续食醋酿造过程提供优良菌源，从而促进食醋品质的提升。

1.2.5 食醋大曲中的乳酸菌

食醋大曲中的产酸菌不仅是传统意义上的醋酸菌，还包括许多乳酸菌。一些乳酸菌除产乙酸外，还能产生乳酸、挥发性风味物质和氨基酸等[32]。氨基酸和乳酸能够对乙酸产生缓冲作用，中和乙酸的刺激性味感，改善食醋风味。此外，乳酸菌产生的代谢产物也能在赋予成品食醋更好口感的同时，给予食醋一定的益生功能，符合现代消费者对保健功能的需求。部分食醋大曲中乳酸菌的研究结果如表3所示。

表3 部分食醋大曲中乳酸菌的研究概况Table 3 Summary of lactic acid bacteria in some vinegar Daqu

近年来乳酸菌产多糖[36]、产细菌素[37]及耐药性[38]等特性备受科研人员关注。食醋作为一种传统发酵食品，其发酵剂大曲中的乳酸菌不仅可为乳酸菌研究提供新的菌种来源，也可针对其代谢产物进行分析并通过生物强化提高食醋的品质。

1.2.6 食醋大曲中的其他微生物

大曲生态系统中的微生物群落结构较为复杂，有些微生物在大曲中的量很少，却发挥着重要作用，如放线菌属（Actinomyces）和泛菌属（Pantoeasp.）等。不同类型大曲的功能微生物菌群存在较大差异，加之不同测序方法之间存在差异性，使得不同食醋大曲可能存在未被发现的特殊微生物。对不同食醋大曲功能微生物菌群进行解析或对比分析，对探究食醋发酵过程及建立大曲与后续发酵过程及产品间的联系尤为重要，有利于大曲以及食醋品质的提升。

2 食醋大曲品质

大曲是食醋酿造的“灵魂”所在，一般认为大曲中含有多种风味物质或风味前体物质，大曲品质直接影响食醋品质。传统上，大曲品质的优劣在感官特征上可以通过外观、断面、香味等进行比较。近年来，随着学者对大曲研究的不断深入，开始涉及到采用一些指标的测定用以表征大曲品质的优劣。优质大曲“穿衣”情况好且均匀、微生物（尤其是霉菌）种类及数量多、酶活力高；而劣质大曲可能会引起食醋品质劣变。Li Pan等[6]研究表明，导致食醋反浑的微生物可在大曲微生物种群中得到溯源。目前针对大曲品质表征指标的研究并不全面，并且鲜有对大曲品质影响因素、大曲品质与食醋品质的联系及大曲品质改良等方面的系统性分析，本文就这4 个方面对食醋大曲品质进行概括总结。

2.1 食醋大曲品质的影响因素

食醋大曲于开放环境中生产，当地气候、水源、土壤等均会对其品质造成影响，进而不利于后续发酵过程。鲜有对食醋大曲生产过程中品质影响因素的概述。食醋大曲品质的影响因素主要为原料及处理、制曲工艺及环境和微生物的影响3 个方面。非生物因素一般通过对微生物造成影响而间接对食醋品质产生影响。

2.1.1 大曲的原料及处理

不同大曲生产过程中所用原料存在较大差异，因此其中的微生物以及提供给微生物生长繁殖的营养物质不同。微生物决定代谢产物，代谢产物决定大曲的风味成分，进而影响大曲品质。原料的预处理，即采用生料或熟料进行发酵以及原料的粉碎程度均会对大曲的品质造成影响。生料所带入的微生物种类较为复杂，每批次原料生产的大曲其微生物群落结构可能存在差异，并且可能会有新的微生物种类出现，而熟料在经过高温蒸煮后杀灭了大多数微生物。生料发酵相对于熟料发酵来说，对大曲品质有一定的促进作用，但其存在的杂菌污染也是需要考虑的问题。此外，某些大曲在生产过程中将母曲作为新曲原料的一部分投入使用，其中的菌系、物系、酶系均会对大曲的品质产生影响。

2.1.2 大曲的制曲工艺及环境

不同的制曲工艺形成了不同醅温的大曲，而不同醅温的大曲因其菌群结构存在差异，品质不尽相同。在制曲过程中不同温度对微生物进行选择，使体系中的微生物向耐受该环境的方向进化，微生物区系发生改变，进而引起大曲品质改变[39-40]。同时此过程中所富集微生物的代谢也会反过来影响曲醅的温度及一系列指标的波动变化。

在制曲过程中，大曲的温度与水分多是通过翻曲及强制通风来实现相对控制，所以翻曲的时间和次数以及曲房通风对于大曲品质尤为重要。另外，环境温度、曲房洁净程度及曲虫的存在也会对大曲品质产生一定影响。

2.1.3 大曲微生物

大曲为微生物的生长繁殖提供丰富的营养物质，微生物可在其中生长、代谢及分泌多种酶类，使大曲具有多种功能；同时原料物质被微生物分解代谢，形成相应的代谢产物，构成食醋的风味物质或风味前体物质，影响食醋品质。另外，一些污染性微生物的存在或某些微生物含量过高也会造成大曲的品质劣变。微生物并非作为单一因素影响大曲品质，大曲中的微生物与制作时的原料及处理、制曲工艺及环境是密不可分的，所以，将三者结合探究其对大曲品质的影响，更具有系统性。

2.2 食醋大曲品质的表征

随着制曲工艺的不断发展，传统食醋大曲品质优劣的感官判断方法正逐渐被指标测定所取代，或是采用两种方法并重的方式进行。目前鲜有系统性的食醋大曲品质表征指标，本文将食醋大曲品质的表征归纳为微生物、理化指标和酶活性与风味成分3 个方面。

2.2.1 食醋大曲微生物的表征

食醋大曲微生物区系是大曲品质最重要的表征因素。大曲于开放环境中生产，菌系较为复杂。某种微生物作为大曲品质优劣的表征主要从其是否为污染菌、是否产生风味物质或风味前体物质以及能否促进后续食醋发酵等方面进行判断。大曲中的微生物主要包括霉菌、酵母菌、细菌和放线菌等。

大曲中的曲霉、根霉和犁头霉分泌糖化酶、淀粉酶、酯化酶等，有利于促进大曲的发酵进程及形成良好的品质。而大曲中存在的其他丝状真菌，如青霉、毛霉、红曲霉等，其一部分对大曲的生产具有积极作用，一部分则是大曲发酵过程中的污染菌，这些污染性霉菌的存在将会严重影响大曲质量。

酵母菌除对大曲的风味产生贡献，也可产生多种酶类促进大曲的发酵进程。扣囊复膜孢酵母可分泌大量淀粉酶、酸性蛋白酶和糖化酶，具有降解淀粉的作用[41-42]。产酯酵母可分泌酯酶，且可与乳酸菌协同作用共同促进大曲香气物质的形成[6,43]。大曲中的其他酵母也与其他微生物协同或单独对大曲的香气物质产生积极作用。

大曲中具有生香功能的细菌主要包括芽孢杆菌、乳酸菌和醋酸菌。其中，芽孢杆菌能分泌淀粉酶和蛋白酶，是大曲风味物质形成的重要菌源，对大曲生产是有利的[44]。在大曲生产过程中，乳酸菌可为酵母菌的酯化作用提供底物，但若大量生长繁殖，则会导致大曲过于酸化，不利于大曲的发酵生产[45]。

2.2.2 食醋大曲理化指标及酶活性的表征

食醋大曲理化性质是验证大曲发酵是否成熟的静态指标，是评价大曲品质的重要指标之一。若发酵成熟的大曲水分含量太高，容易引起大曲发生二次霉变，从而降低其质量。适当的酸度可以抑制有害杂菌在大曲中生长，同时也可作为前体物质参与酯化反应生成一些风味物质。优质大曲中淀粉残量低于普通大曲，并且淀粉残量与糖化酶和液化酶的活性高低有关。

大曲酶系是大曲作为糖化发酵剂的根本所在，液化酶和糖化酶有利于提高原料利用率，但糖化力过高会导致产酸菌繁殖，从而影响大曲品质；蛋白酶主要贡献于大曲曲香物质的形成；酯化酶能促进酯类化合物的生成；纤维素酶能破坏原料的细胞壁结构，释放淀粉，有利于淀粉酶作用，进而提高原料利用率和出醋率[16]。

理化指标及酶活性是大曲品质的重要表征因素，在一定程度上，理化指标及酶活性对于大曲品质的表征与微生物的多样性及演替密不可分。

2.2.3 食醋大曲风味物质的表征

大曲体系复杂，在发酵过程中微生物利用原料产生一系列代谢产物，形成风味物质或风味前体物质。优质大曲中游离氨基酸和微量挥发性成分的总量均高于普通大曲，所以风味物质可作为大曲品质的一个表征因素。各指标均会对大曲品质造成影响，对大曲品质的表征应该综合考虑这3 个方面因素。

2.3 食醋大曲品质与食醋品质的相关性

食醋大曲中含有复杂多样的微生物系和酶系，是主要的糖化发酵剂，可控制发酵进程，其品质直接影响食醋的风味、品质和出醋率[16,46]。高酸和高酯是高品质食醋的两个重要指标，大曲是其中产酸、产酯过程中较为重要的环节[47]。良好的食醋品质由很多因素决定，特别是发酵过程中的微生物区系，在食醋中发现的绝大部分风味物质是由大曲中的微生物发酵产生，且大曲中存在的污染性微生物也会对食醋品质造成影响[6]。此外，大曲发酵过程中理化指标的动态变化最终也会影响食醋品质。大曲中微生物代谢产生一系列的风味物质或风味前体物质，这些物质或是直接进入食醋体系中，或是在后续发酵过程中进一步反应形成风味物质，形成食醋独特的风味。大曲作为固态发酵中不可或缺的一部分，影响其品质的微生物、理化性质和酶活性及风味物质大都是通过影响大曲品质进而对食醋品质产生影响，因此，大曲品质直接决定食醋的品质。

2.4 食醋大曲品质的改良

传统食醋大曲的生产是我国谷物醋的一大特色，其于开放环境中进行，发酵过程并未特意接种微生物[2]；生产所用原料、接触的工具以及环境均未进行消毒或灭菌处理[47]；生产受季节影响较大，且曲块质量还取决于操作者的技能，而操作者对于生产过程中涉及的微生物及生化反应知之甚少[8]；基于以上因素，在实际生产中，虽然近年来大曲制造技术已相对成熟，但大曲品质的不一致性和不稳定性仍然是一个亟需解决的问题，且自然发酵过程中引入的杂菌也是食醋安全隐患问题的所在[48]。目前，在保证大曲质量的前提下，如何机械化、现代化、标准化制曲是目前制曲行业的共性问题。

在未大规模改变原有生产模式的前提下使大曲品质得到改善，需要对曲房环境、原料、制作工艺以及大曲中的微生物等进行控制，前三者可以通过制定相应的企业标准来实现，而大曲中的微生物可通过生物强化的方式来改变，进而控制发酵过程。

2.4.1 生物强化技术

生物强化技术是指将具有特定功能的微生物加入一定环境系统中，从而改变该系统中的菌系组成，增强某种功能性微生物丰度，稳定微生物菌群结构以及实现该种微生物功能的强化[49]。生物强化技术最初应用于工业废水处理[50]，之后在其他领域也得到了一定的应用和发展，特别在食品发酵领域属于一大研究热点[51-54]，在中国传统食醋行业中的应用处于初级阶段。

2.4.2 食醋大曲的生物强化

随着生物强化技术在发酵食品中应用的推广，对于食醋大曲的生物强化也进入了不断探索的阶段。部分食醋大曲生物强化的研究结果如表4所示。

表4 部分食醋大曲生物强化的研究概况Table 4 Outcomes achieved in bioaugmentation of some vinegar DDaaqquu

大曲的生物强化对于食醋品质的提升具有积极作用，并可在一定程度上稳定大曲的微生物群落结构，或在某个阶段提高某些功能微生物含量，从而增加某些代谢产物的含量。微生物多样性会影响食醋品质，发生显著改变后可能会使食醋的独特风味和口感发生恶化，因此对于生物强化后菌群显著改变对食醋品质的影响还有待进一步研究。在未来食醋大曲的生产研究中，可以适当地采用生物强化方法，并根据实际情况进行改良，对食醋大曲品质的改善以及促进食醋品质和出醋率提高等方面具有积极作用。

3 结 语

食醋大曲作为中国谷物醋固态发酵过程中的一大特色，对于食醋的生产、风味、品质等具有重要作用。国内生产的食醋大曲大多采用自然接种，在开放式环境中培养，整个过程中大多依靠操作者的经验进行，生产未能实现工业标准化、机械化和现代化，食醋大曲品质稳定性较差，受季节等因素影响较大。在生产过程中环境、原料以及生产器具中的微生物均会进入到大曲体系中，菌群结构较为复杂，且引入的污染性微生物会导致食醋品质劣变。食醋企业未针对不同季节、不同批次大曲在整个发酵过程中的菌群演替进行探究；尚未建立完整的功能菌种库，用以保存本土优良菌种以备后续使用。此外，大曲发酵过程中的优势功能微生物及其作用机制尚未明晰；大曲受不同环境因子影响的菌群变化相关研究较少；食醋大曲品质优劣指标的表征缺乏系统研究，相应标准尚未建立；大曲品质对食醋品质的贡献模糊。这些方面研究的不完善制约了食醋大曲品质的改良，也在一定程度上影响食醋品质。

近年来，对食醋大曲菌群结构及其功能性微生物筛选应用的研究处于初级阶段，对大曲品质及改良等方面的研究较少。不同食醋大曲发酵过程中菌群结构的季节性、批次间、不同醅层间的差异需要更多基础数据支撑；需建立不同食醋大曲的功能菌种库，规避因环境长期驯化而使自身独特的微生物被淘汰的风险；探究食醋大曲品质表征的具体指标，避免以经验为主的传统框架限制；剖析大曲品质与食醋品质之间的内在关系，具体为在大曲到成品食醋的整个生产流程中探究大曲中形成的风味物质是否由醋醅传递到成品食醋，或是大曲中形成的风味物质中是否存在醋醅、食醋中风味物质的前体物质，进一步研究大曲品质劣变对食醋品质、出醋率等方面的影响；应用转录组、蛋白组学等对不同食醋大曲中微生物受环境胁迫的应答机制进行具体探究；应对不同大曲中存在的多种功能微生物进行发酵性能研究，进一步发掘生物强化菌种，避免引入外源强化菌株可能造成的污染；结合多种影响因素优化食醋大曲的生物强化，改善食醋大曲的品质，提升食醋的产量与品质。