小麦低聚肽对急性酒精中毒小鼠抗氧化功能的影响

于兰兰，刘 伟，周雅琳，李 雍，秦 勇，李睿珺，许雅君*

（北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室，北京 100191）

含乙醇饮料在世界各地消费广泛，然而过量饮酒可能会导致一系列的健康问题，如酒精性肝炎、心脏病、神经血管性炎症等[1-2]。肝脏是人体新陈代谢及解毒的重要器官，过量饮酒引起的氧化应激、促炎介质及诱导细胞凋亡会加剧酒精性肝炎的进展[3-4]。其中，氧化应激被认为是许多疾病的潜在病理和生理核心，乙醇或其代谢产物可以通过增加人体内的自由基或活性氧来降低机体抗氧化水平[5]；因此抗氧化剂是治疗急性和慢性酒精中毒的良好策略[6]。抗氧化活性肽是最近被广泛研究的一类天然活性肽，其通过减少氧自由基、羟自由基和阻断脂质体氧化过程中的链式反应，从而达到抗氧化、延缓衰老的作用[7]。本实验以小麦低聚肽为研究对象，将健康小鼠灌胃不同剂量小麦低聚肽30 d后，进行急性酒精氧化损伤造模，观察小鼠血清和肝脏氧化应激指标的变化，旨在探讨小麦低聚肽对急性酒精中毒诱导氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清洁级健康雄性ICR小鼠，体质量约25～30 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0010。动物饲养于屏障环境中，饲养环境温度（23±2）℃，相对湿度50%～60%，明暗交替12 h∶12 h。本研究实验方案通过北京大学公共卫生学院动物伦理委员会审批。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、蛋白定量、蛋白质羰基含量检测试剂盒 南京建成生物工程研究所；无水乙醇（优级纯） 北京市通广精细化工公司。

1.2 仪器与设备

SPN3001F电子天平 奥豪斯仪器（上海）有限公司；FLUOstar Omega多功能酶标仪 德国BMG Labtech公司；BFX5-320型低温自动平衡离心机 中国白洋离心机厂；Allegra X-30台式高速冷冻离心机美国Beckman公司；HH S11-1电热恒温水浴锅 上海华联环境实验设备公司恒昌仪器厂；紫外分光光度计上海第三分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 小麦低聚肽的提取

小麦低聚肽以小麦谷朊粉为原料，采用酶耦联技术和多级分离技术，制备得到分子质量集中在200～1 000 Da的小分子肽[8-9]。

主要工艺流程：小麦谷朊粉→调浆乳化→双酶酶解→卧螺离心→灭酶→蒸发浓缩→灭菌→喷雾干燥→成品小麦低聚肽。

依据GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》，采用氨基酸自动分析仪对小麦低聚肽中的氨基酸组成进行测定，结果见表1。

表1 小麦低聚肽的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of wheat oligopeptides

1.3.2 实验动物分组及模型建立

参照国家食品药品监督管理总局发布的抗氧化功能评价方法[10]，小鼠经1 周适应期后，按照体质量将60 只小鼠随机分为5 组，分别为空白对照组、模型组及小麦低聚肽低、中、高剂量组，每组12 只。各组均给予基础饲料，自由进食、饮用无菌去离子水。实验期间每日8∶00－10∶00，小麦低聚肽低、中、高剂量组小鼠分别灌胃0.4、0.8、1.6 g/kgmb小麦低聚肽水溶液，空白对照组和模型组小鼠灌胃等体积的蒸馏水，连续灌胃30 d。每6 d记录小鼠体质量和摄食量。

末次灌胃后，空白对照组小鼠不禁食禁水，模型组和小麦低聚肽低、中、高剂量组小鼠禁食不禁水16 h，第二天晨起按照12 mL/kgmb一次性灌胃体积分数50%的乙醇溶液，造成小鼠急性酒精中毒。

1.3.3 指标测定

灌胃体积分数50%乙醇溶液6 h后，各组动物摘眼球取血后脱颈处死，收集各组小鼠血液，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液备用；取肝脏组织匀浆。按照试剂盒操作步骤测定小鼠血清和肝脏中GSH水平、T-SOD活力、MDA水平以及肝组织蛋白质羰基和蛋白含量。

1.4 数据统计与分析

实验结果均以平均值±标准差表示。所有数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析比较组间差异，P＜0.05认为差异具有统计学意义。方差齐时，采用最小显著性差异法进行两两比较；方差不齐时，采用Tamhane’s T2法进行两两比较。

2 结果与分析

2.1 小麦低聚肽对小鼠体内GSH水平的影响

图1 小麦低聚肽对小鼠血清和肝脏GSH水平的影响Fig. 1 Effects of wheat oligopeptides on GSH levels in serum and liver of mice

由图1可知，一次性灌胃体积分数50%乙醇溶液后，模型组小鼠血清和肝脏中GSH水平分别极显著（P＜0.01）和显著（P＜0.05）低于空白对照组，这表明急性酒精中毒诱导小鼠产生氧化损伤，导致小鼠肝脏和血清中抗氧化物质GSH水平降低。与模型组比较，小麦低聚肽低剂量组小鼠血清中GSH质量浓度显著升高（P＜0.05），肝脏中GSH含量极显著升高（P＜0.01）；小麦低聚肽中、高剂量组小鼠血清和肝脏中GSH水平与模型组差异不显著。由此判定，低剂量的小麦低聚肽具有提高急性酒精中毒小鼠体内抗氧化物质GSH水平的作用。

2.2 小麦低聚肽对小鼠体内T-SOD活力的影响

图2 小麦低聚肽对小鼠血清和肝脏中T-SOD活力的影响Fig. 2 Effects of wheat oligopeptides on T-SOD activity in serum and liver of mice

由图2可知，一次性灌胃体积分数50%乙醇溶液后，与空白对照组相比，模型组小鼠血清和肝脏中的T-SOD活力分别显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）低于空白对照组，表明急性酒精中毒诱导的小鼠氧化损伤降低了机体内T-SOD活力。与模型组比较，仅小麦低聚肽低剂量组小鼠的血清T-SOD活力显著提高（P＜0.05），而小麦低聚肽各剂量组小鼠的肝脏T-SOD活力均极显著高于模型组（P＜0.01）。由此判定，小麦低聚肽，尤其是低剂量时，具有增强急性酒精中毒小鼠体内T-SOD活力的作用。

2.3 小麦低聚肽对小鼠体内MDA水平的影响

图3 小麦低聚肽对小鼠血清和肝脏MDA水平的影响Fig. 3 Effects of wheat oligopeptides on MDA levels in serum and liver of mice

由图3可知，一次性灌胃体积分数50%乙醇溶液后，与空白对照组相比，模型组小鼠血清MDA浓度增加，但不显著，肝脏中MDA含量显著增加（P＜0.05），表明急性酒精中毒诱导小鼠发生氧化损伤，促使小鼠体内发生脂质过氧化，导致小鼠血清和肝脏中MDA水平升高。与模型组相比，仅小麦低聚肽高剂量组小鼠血清MDA浓度显著降低（P＜0.05）。由此判定，小麦低聚肽具有抑制脂质过氧化的作用。

2.4 小麦低聚肽对小鼠肝脏蛋白质羰基含量的影响

图4 小麦低聚肽对小鼠肝脏蛋白质羰基含量的影响Fig. 4 Effects of wheat oligopeptides on protein carbonyl content in liver of mice

由图4可知，一次性灌胃体积分数50%乙醇溶液后，模型组小鼠肝脏中蛋白质羰基含量极显著高于空白对照组（P＜0.01），表明急性酒精中毒诱导的小鼠氧化损伤可破坏机体肝脏蛋白质一级结构，导致蛋白质羰基含量增加。小麦低聚肽低剂量组小鼠肝脏中的蛋白质羰基含量显著低于模型组（P＜0.05），中、高剂量组与模型组差异不显著。由此判定，低剂量的小麦低聚肽具有抑制蛋白质过氧化的作用。

综上，根据国家食品药品监督管理总局印发的抗氧化功能评价方法[10]中评价结果的判定原则，本实验中急性酒精中毒小鼠灌胃小麦低聚肽后，小鼠血清和肝脏脂质过氧化物MDA水平、蛋白质氧化产物蛋白质羰基含量、抗氧化酶T-SOD活力、抗氧化物质GSH水平4 项指标均为阳性，可判定小麦低聚肽抗氧化动物实验的结果为阳性。

3 讨 论

本实验通过小麦低聚肽干预动物实验，研究其对急性酒精中毒造成小鼠氧化损伤的保护作用。本研究利用生长期健康小鼠，连续灌胃小麦低聚肽（0.4、0.8、1.6 g/kg mb）干预30 d，实验期内各组小鼠体质量和摄食量均没有显著差异，说明在本实验剂量下，受试物小麦低聚肽不会对小鼠的正常生长造成不良影响，没有影响其对食物的正常利用，这为后续小鼠急性酒精中毒奠定基础。

活性氧是生物系统在代谢过程中不断自发生成的一种促氧化剂，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢和一氧化氮[11]。适量的自由基为人体生命活动和各组织细胞生长代谢所必需，而过量的活性氧自由基则会攻击蛋白质、多糖、核酸和多不饱和脂肪酸，导致细胞损伤及线粒体功能障碍[12]。过量活性氧积聚和自由基清除能力的下降是酒精性肝损伤的主要原因之一[13]。大量摄入乙醇时，乙醇在肝脏中的主要代谢产物乙醛激活氧分子产生自由基，诱导产生大量活性氧，降低抗氧化系统水平，使机体内自由基的生成和清除机制失衡，进而损伤机体的大分子（脂肪、蛋白质、DNA等），如脂质过氧化、抗氧化酶系统失活、DNA突变以及细胞膜的破坏，最终导致整个细胞的损伤[14-16]。

抗氧化酶在乙醇、许多有毒物质和活性氧的解毒过程中发挥重要作用。SOD是人类最重要的抗氧化酶之一。人体内存在3 种SOD，其中SOD2是唯一被证明对氧化呼吸至关重要的抗氧化酶，线粒体内生成的活性氧被SOD2还原为过氧化氢，而过氧化氢又被谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶进一步还原为水[17-18]。Kubota等[19]研究发现在喂食富含乙醇饲料的大鼠中，SOD2过表达可以减轻乙醇引起的肝损伤。有研究表明，在急性酗酒模型中，小鼠SOD2的高表达对肝脏具有保护作用[20]。GSH是一种具有重要生理功能的天然活性三肽分子，保护细胞免受氧化应激诱导的细胞损伤，且在毒物、致癌物及药物代谢的解毒方面具有重要作用。它可清除超氧阴离子自由基、H2O2、过氧化脂质，稳定含巯基的酶，防止血红蛋白及其他辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生毒性作用，因此GSH含量是衡量机体抗氧化能力的重要指标[21-22]。本研究中，与模型组相比，小麦低聚肽低剂量组小鼠血清T-SOD活力、GSH质量浓度显著升高，肝脏T-SOD活力、GSH含量极显著升高。这表明小麦低聚肽能通过升高抗氧化酶活性及抗氧化物质含量，从而加强机体防御体系的抗氧化能力，防止急性酒精中毒引起的肝损伤。

蛋白质羰基化是氨基酸残基侧链受到氧自由基攻击最后转变成羰基产物，是氧化应激中一种不可逆的化学修饰。蛋白质羰基化参与多种疾病的生理病理过程，如蛋白质羰基化启动凋亡的过程。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质氧化修饰过程中的早期标志，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度[23]。机体内存在着大量的不饱和脂肪酸，极易受到过氧化作用的损伤。MDA是脂质过氧化反应链式终止阶段产生的小分子产物，是目前公认能反映氧自由基产生及引发的脂质过氧化反应的间接指标，其含量可以间接反映自由基的产生情况和机体组织细胞的脂质过氧化程度[24]。本研究中，与模型组相比，小麦低聚肽低剂量组小鼠肝脏蛋白质羰基含量显著降低；小麦低聚肽高剂量组小鼠血清MDA浓度显著降低。这表明，小麦低聚肽能降低自由基对肝脏蛋白的损伤程度，且对细胞膜的脂质过氧化有一定的减轻作用。

小麦低聚肽是小麦蛋白经酶水解得到的结构片段，其中谷氨酸质量分数最高。研究表明小麦低聚肽含有丰富的谷氨酰胺，可以作为谷氨酰胺的优良补充剂[25]。谷氨酰胺被证明是GSH的主要前体物质，这可能与小麦低聚肽发挥其抗氧化作用有关。肝脏对GSH的合成依赖于肝细胞内的谷氨酸和谷氨酰胺。Schemitt等[26]研究发现谷氨酰胺保护肝细胞的作用机制包括GSH的抗氧化作用，GSH依赖于谷氨酸的供应，而谷氨酸又可以由谷氨酰胺酶水解谷氨酰胺产生。高浓度乙醇会导致GSH氧化还原循环失衡，导致肝损伤。本研究中，小麦低聚肽能够提高急性酒精中毒小鼠肝脏组织中的GSH含量，显示其具有肝脏保护作用。Gouvêa等[27]研究发现预先摄入谷氨酰胺可提高肾缺血再灌注大鼠的总抗氧化能力和GSH过氧化物酶水平。李松涛等[28]研究发现短期补充外源性谷氨酰胺可显著提高大鼠血清SOD活力及降低MDA水平，表明谷氨酰胺具有一定的抗氧化作用。蛋白质羰基化是蛋白质损伤的重要标志，与氧化应激、疾病和衰老有关。脯氨酸、精氨酸等氨基酸侧链受到活性氧自由基攻击会形成蛋白质衍生的羰基产物[29]。补充蛋白质羰基化过程中损伤的特定蛋白质或氨基酸，有利于减轻活性氧对机体重要蛋白的损伤。小麦低聚肽中含有的氨基酸可以直接被机体吸收并参与机体多种代谢反应，这可能与小麦低聚肽降低自由基对蛋白质的损伤有关。改变不良生活方式、摄入天然抗氧化剂或通过药物降低氧化应激生物标志物的含量通常被认为是有益于健康的行为[30]。本研究结果表明，小麦低聚肽能提高急性酒精中毒小鼠体内的抗氧化能力，并对急性酒精中毒小鼠肝损伤具有一定的缓解作用。本实验通过对植物活性肽小麦低聚肽的抗氧化功能进行研究与分析，为功能性保健品的开发和利用提供了依据，但仍需要进一步探寻小麦低聚肽抗氧化功能的组织病理及作用机制。