长黑青稞中不同形态多酚的提取及体外抗氧化活性

朱昱琳，杨士花，黄勇桦，李永强,*，张建平，李 晴，陈 壁，初雅洁，李 淳，黄艾祥

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学外语学院，云南 昆明 650201；3.云南昆明国家粮食储备中转库，云南 昆明 650201；4.大理农林职业技术学院，云南 大理 671003；5.永平县综合检验检测院，云南 永平 672660）

多酚是一类广泛存在于植物中的次生代谢产物，能抑制脂质和其他生物分子过氧化[1]，具有清除自由基、抗炎、抑菌、延缓衰老和增强机体免疫力等作用[2-4]，能够预防心血管疾病[5]、糖尿病[6]和癌症[7]等。多酚按结构分为黄酮、酚酸、芪类和木脂素等[8]，根据溶解性可分为可溶性和不可溶键合多酚[9]。可溶性多酚可利用水溶液或水与甲醇、丙酮等有机溶剂混合进行提取[10]。不可溶键合多酚主要以酯键和醚键等形式与碳水化合物、蛋白质等生物大分子物质结合[9,11]，无法利用溶剂直接提取，一般采用酸解、碱解或酶解后再进行提取[12]。

由于膳食多酚具有促进健康的潜在功能，其提取和生物活性成为近年来的研究热点。研究发现，大麦[3]、水果[13-15]、坚果[16]、加工废弃物[17-18]中可溶性多酚的含量高于不可溶键合多酚，并且可溶性多酚具有更 高的抗氧化活性。研究者从茶籽[19]、水果[20-21]、谷物[10,22-24]中提取了游离、酯化和不可溶键合多酚，其中不可溶键合多酚的含量及其抗氧化活性最高。陆洋等[25]从老黑谷米面粉中提取分离了可溶性、游离、酯化、醚化和键合多酚，发现可溶性多酚的含量和体外抗氧化能力最高。蜂蜜[2]、大麦[3]和水果[14]中可溶性多酚具有显著的抗炎和抗增殖能力。同时，研究发现谷物中的多酚主要是酚酸和黄酮，其中酚酸包括羟基苯甲酸和羟基肉桂酸，并且阿魏酸是主要的酚类化合物[10,24,26]。

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook.f.）是一种成熟后外稃与颖果分离且籽粒裸露的大麦[27]，是云南省迪庆藏族自治州的特色农作物，其在极寒、低温和强紫外线辐射的逆境下积累了大量的多酚化合物[28-29]。目前国内外对总可溶性多酚的研究较多，忽略了不可溶键合多酚，因此不能准确反映多酚的真实含量和生物活性。张一鸣等[29]对云黑青稞中的可溶性多酚进行了提取和纯化工艺的研究。但对于长黑青稞中不同形态多酚的提取、含量测定及其生物活性研究鲜见报道。本实验在前期研究的基础上对长黑青稞中总可溶性、游离、醚化、酯化和不可溶键合多酚进行提取，测定5 种多酚的多酚含量、黄酮含量和体外抗氧化活性，并分析5 种形态多酚的化合物组成，为客观评价长黑青稞中多酚含量和抗氧化活性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长黑青稞样品购自云南省迪庆藏族自治州农业科学研究所。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、Folin-Ciocalt eu试剂、Trolox美国Sigma公司；三 吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine，TPTZ）、2,2-联氨双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonate，ABTS）、三氯乙酸、三氯化铁、过氧化氢、硫酸亚铁、抗坏血酸 上海晶纯生化科技股份有限公司；没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香草醛、(－)-表没食子儿茶素、对香豆酸、阿魏酸、杨梅素、槲皮素、反式肉桂酸、山柰酚、芹菜素 北京北纳创联生物技术研究院；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MF-304型不锈钢五谷杂粮磨粉机 广州雷迈机械设备有限公司；A360型紫外-可见分光光度计 翱艺仪器（上海）有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-3E数字型pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多酚化合物的提取

参考Chandrasekara[10]、陆洋[25]、邹青飞[30]等的方法并稍作修改。将脱脂后的长黑青稞样品用体积分数70%丙酮溶液提取，离心得上清液和残渣，上清液即为总可溶性多酚，残渣用来提取不可溶键合多酚。总可溶性多酚用12 mol/L HCl溶液调节pH值至2，与乙醚等体积混合萃取5 次，有机相即为游离多酚；提取游离多酚后的水相用2 mol/L NaOH溶液室温下水解4 h，用HCl溶液调节pH值为2，室温下4 000×g离心10 min，用乙醚和乙酸乙 酯等体积混合，萃取5 次，有机相即为酯化多酚；提取酯化多酚后的水相加入20 mL 1 mol/L HCl溶液，95 ℃水浴中加热45 min，室温下冷却，用乙醚等体积混合，提取5 次，有机相即为醚化多酚。提取总可溶性多酚后的残渣用4 mol/L NaOH溶液水解，用6 mol/L HCl溶液调节pH值至2，室温下4 000×g离心30 min，上清液用乙醚和乙酸乙酯等体积混合，萃取5 次，有机相即为不可溶键合多酚。所有多酚提取物均充氮气于0～4 ℃下避光保存备用。

1.3.2 多酚化合物含量测定

1.3.2.1 多酚含量测定

多酚含量测定采用Li Qing[9]、邹青飞[30]、Guo Weiwei[31]等改进的Folin-Ciocalteu法。以阿魏酸为标准品制定标准曲线：y＝1.289x－0.003（R2＝0.998），根据标准曲线计算多酚含量，所得结果用每克长黑青稞干样品中阿魏酸物质的量表示，单位为μmol/g。

1.3.2.2 黄酮含量测定

黄酮含量测定采用改进的AlCl3比色法[32]。以儿茶素为标准品制定标准曲线方程：y＝2.545 9x－0.011 4（R2＝0.999），根据标准曲线计算黄酮含量，所得结果用每克长黑青稞干样品中儿茶素物质的量表示，单位为μmol/g。

1.3.3 体外抗氧化活性测定

1.3.3.1 铁离子还原/抗氧化能力测定

铁离子还原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的测定参考Li Qing[9]和Benzie[33]等的方法并稍作修改。取适量的样品溶液与3 mL FRAP溶液充分混合，于37 ℃下放置4 min，在593 nm波长处测定其吸光度。以甲醇作为空白。用FeSO4制定标准曲线，标准曲线方程为：y＝6.24x+0.000 5（R2＝0.998）。式中：y为吸光度；x为硫酸亚铁浓度/（mmol/L）。FRAP以每克长黑青稞干样品中Fe2+的物质的量表示，单位为mmol/g。

1.3.3.2 过氧化氢清除能力测定

过氧化氢清除能力（hydrogen peroxide scavenging activity，HPSA）测定参考黄佳琦等[34]的方法。吸取适量样品溶液，加入2.4 mL磷酸盐缓冲液（45 mmol/L、pH 7.4）和0.9 mL过氧化氢溶液（40 mmol/L）；30 ℃水浴反应40 min，在230 nm波长处测定其吸光度。以甲醇作为空白。用阿魏酸制定标准曲线，标准曲线方程为：y＝47.338x+32.772（R2＝0.998）。式中：y为过氧化氢清除率/%；x为阿魏酸浓度/（μmol/L）。过氧化氢清除率按式（1）计算。HPSA以每克长黑青稞干样品中阿魏酸的物质的量表示，单位为μmol/g。

式中：A0为空白溶液的吸光度；A1为样品的H2O2溶液的吸光度。

1.3.3.3 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除能力（DPPH radical scavenging activity，DRSA）测定参考Li Qing[9]和Hatano[35]等的方法。吸取适量样品溶液，加2 mL DPPH-甲醇溶液，混匀，室温下暗处放置10 min，在517 nm波长处测定其吸光度。以甲醇作为空白溶液。用阿魏酸制定标准曲线，标准曲线方程为：y＝451.75x+32.31（R2＝0.998）。式中：y为DPPH自由基清除率/%；x为阿魏酸浓度/（μmol/L）。DPPH自由基清除率按式（2）计算。DRSA以每克长黑青稞干样品中阿魏酸的物质的量表示，单位为μmol/g。

式中：A0为空白溶液的吸光度；A1为样品的DPPH-甲醇溶液的吸光度。

1.3.3.4 总抗氧化能力测定

总抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）测定参考Re等[36]的方法并稍作修改。吸取适量样品溶液，加入3.8 mL提前配制的ABTS溶液，室温下反应6 min后，在734 nm波长处测定其吸光度。以甲醇作为空白溶液。用Trolox制定标准曲线，标准曲线方程为：y＝103.95x+1.566 3（R2＝0.998）。式中：y为ABTS阳离子自由基清除率/%；x为Trolox浓度/（mmol/L）。ABTS阳离子自由基清除率按式（3）计算。TEAC以每克长黑青稞干样品中Trolox的物质的量表示，单位为μmol/g。

式中：A0为空白溶液的吸光度；A1为样品中加入ABTS溶液的吸光度。

1.3.4 青稞多酚化合物高效液相色谱分析

参照Li Qing[9]、邹青飞[30]等的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）方法对青稞总可溶性、游离、酯化、醚化和不可溶键合多酚提取物中酚类化合物进行组成分析。HPLC条件为色谱柱：Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 mL/min；进样量：1 μL；柱温：30 ℃；检测器：G1315B23二极管阵列检测器；检测波长280 nm，梯度洗脱程序：0 min，5%（体积分数，下同）甲醇（体积分数0.5%甲酸-水溶液配制，下同）；20 min，95%甲醇；21 min，5%甲醇；25 min，5%甲醇。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 长黑青稞中多酚化合物含量

图1 长黑青稞中总可溶性、游离、酯化、醚化和不可溶键合多酚提取物中多酚和黄酮含量Fig. 1 Contents of polyphenols and fl avonoids in total soluble, free,esterified, etherified, and insoluble-bound phenolic fractions from‘Changhei’ hulless barley

由图1A可见，长黑青稞中总可溶性多酚含量最高，为（16.97±0.25）μmol/g，同时不可溶键合多酚含量显著高于游离、酯化和醚化多酚（P＜0.05）。Zhu Yong[3]、陆洋[25]、Chandrasekara[37]等研究发现谷物中总可溶性多酚含量高于不可溶键合多酚。Kim[20]研究发现浆果中不可溶键合多酚含量显著高于游离和酯化多酚，这与本研究结果相一致。说明青稞中总可溶性多酚占较大比例，多酚化合物能够与膳食纤维通过共价键和非共价键结合形成不可溶键合多酚。由图1B可见，5 种多酚提取物中黄酮含量变化和多酚类似，总可溶性黄酮含量最高，为（1.08±0.11）μmol/g，显著高于其他4 种黄酮。Chandrasekara等[37]报道过类似的实验结果，发现小米中可溶性黄酮含量高于不可溶键合黄酮。

2.2 长黑青稞多酚的体外抗氧化活性

图2 长黑青稞中5 种多酚提取物的抗氧化活性Fig. 2 Antioxidant activities of 5 phenolic fractions from ‘Changhei’hulless barley

如图2所示，长黑青稞中5 种多酚的FRAP、DRSA和TEAC变化趋势和多酚含量类似，总可溶性多酚最高，不可溶键合多酚其次，二者都显著高于游离、酯化和醚化多酚（P＜0.05）。在HPSA中，不可溶键合多酚最高，游离、酯化和醚化多酚显著低于总可溶性多酚（P＜0.05）。研究发现，谷物[9,37]、水果[13]、坚果[16,18]中可溶性多酚的FRAP、DRSA、TEAC高于不可溶键合多酚。Chandrasekara等[37]研究发现小米中不可溶键合多酚的HPSA比可溶性多酚高，这与本研究结果一致。说明多酚体外抗氧化活性的差异可能与多酚含量及其酚类化合物组成和结构特征有关。

2.3 多酚含量与抗氧化能力间的相关性

表1 长黑青稞中5 种多酚的多酚含量与抗氧化能力的相关性Table 1 Correlation between phenolic contents and antioxidant capacities of 5 phenolic fractions from‘Changhheeii’ hulless b arrlleeyy

由表1可知，长黑青稞的多酚含量与4 种抗氧化能力之间均存在显著正相关，且FRAP与DRSA和多酚含量间呈现极显著正相关（R2＝0.966和0.998），说明长黑青稞的抗氧化能力与多酚含量有关，而且可能与多酚化合物种类和结构存在一定关系[38-39]。

2.4 长黑青稞酚类化合物的组成分析结果

本实验对长黑青稞中5 种多酚的18 种酚类化合物组成进行了HPLC分析，通过对比18 种标准品的保留时间和峰面积，确定长黑青稞中5 种多酚的酚类化合物组成和含量（图3）。

图3 酚类化合物标准品HPLC图Fig. 3 HPLC chromatograms of mixture of phenolic compounds standards

从表2中可知，长黑青稞多酚中含有18 种酚类化合物，包括羟基苯甲酸、羟基肉桂酸和类黄酮3 类。在羟基苯甲酸中，总可溶性多酚中香草酸含量最高；不可溶键合多酚中香草醛含量最高；游离、酯化和醚化多酚中原儿茶酸含量最高。在羟基肉桂酸中，总可溶性多酚中咖啡酸含量最高；游离、酯化、醚化和不可溶键合多酚中阿魏酸含量最高；不可溶键合多酚中阿魏酸含量显著高于其他4 种多酚，Zhu Yong[3]和Adom[40]等发现，谷物中有98%阿魏酸都是以结合态形式存在，并且阿魏酸是谷物中最丰富的酚类化合物。在类黄酮中，总可溶性、游离、酯化和醚化多酚中儿茶素含量最高，不可溶键合多酚中杨梅素含量最高。

表2 长黑青稞中5 种多酚提取物的酚类化合物含量Table 2 Contents of phenolic compounds in 5 phenolic fractions from‘Changghheeii’ hulless barley

3 结 论

从长黑青稞中提取总可溶性、游离、酯化、醚化和不可溶键合5 种形态多酚，分别测定了多酚含量、黄酮含量、酚类化合物组成和体外抗氧化活性，发现长黑青稞中总可溶性多酚和黄酮含量最高，分别为（16.97±0.25）μmol/g和（1.08±0.11）μmol/g；总可溶性多酚的FRAP、DRSA和TEAC均高于其他4 种多酚，不可溶键合多酚的4 种抗氧化能力均显著高于游离、酯化和醚化多酚；多酚的体外抗氧化能力与含量呈显著正相关（R2＝0.880～0.998）；同时，通过对多酚的组成分析可知，长黑青稞中酚类化合物包括羟基苯甲酸、羟基肉桂酸和类黄酮3 类，含有18 种酚类化合物，其中原儿茶酸、阿魏酸和儿茶素含量较高。综上，长黑青稞多酚具有较好的抗氧化活性。本实验可为长黑青稞的开发利用提供科学依据。