制备条件对结冷胶流体凝胶形成的影响

陈 青，李 荣，周涛涛，程红梅，韩晓祥

（浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018）

食品胶体是亲水性的生物高分子材料，其在食品微观结构、稳定性等方面发挥着重要的作用，通过对食品胶体的结构进行调控，可实现对食品质构、营养和风味的调节[1-2]。近年来，研究者发现将食品胶体（多糖和蛋白质）制成流体凝胶可用来对食品的质构特性和微观结构进行设计和控制[3]。与静态凝胶不同[4-5]，流体凝胶是在多糖或蛋白质凝胶的过程中同时施加剪切流场，形成具有凝胶颗粒的高浓度悬浮液。流体凝胶在静止时表现为固体，超过一定的剪切力才会发生流动，这种独特的流变性质使其可作为增稠剂、人工泪液、药物输送载体等应用在食品、化工、医药等领域[6-9]。

目前关于流体凝胶的研究主要集中在琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、乳清蛋白等方面。琼脂流体凝胶可以稳定泡沫，质量分数为2.5%～3.0%的琼脂流体凝胶对泡沫的稳定性最好[10]，Norton等[11]发现琼脂流体凝胶粒子可以取代全脂蛋黄酱中的大部分油滴，有望成为脂肪的替代物。Farrés等[12]发现溶剂会影响流体凝胶的润滑性，与葡萄糖相比，甘油对流体凝胶润滑性质的影响更为显著。Gabriele等[13]发现严格控制降温速率可制得小粒径（小于5 μm）、窄分布的卡拉胶流体凝胶。Farrés等[14]发明了一种利用针型搅拌器制备海藻酸钠流体凝胶的方法，可制得平均粒径小于10 μm的流体凝胶。分离乳清蛋白流体凝胶粒径与其所受的剪切力和热历史密切相关，降温速率越快，受到的剪切速率越小，得到的凝胶粒径则越大[15]。Wang Yanchao等[16]考察了pH值对南极虾蛋白流体凝胶流变性质和微观结构的影响，发现pH值为5.5或7.2时得到的凝胶强度最大，流体凝胶黏度在pH 7.2时最大，该流体凝胶可用作食品增稠剂。

结冷胶是一种阴离子多糖，在食品工业中经常作为增稠剂、胶凝剂和质构改良剂，结冷胶静态凝胶的研究目前较为广泛[17-19]，但由于流体凝胶制备条件较为苛刻，需要灵敏度较高且可恒速降温的温控系统以及精准控制的剪切系统，因此，关于结冷胶流体凝胶的研究还较少。国内外研究者一直在探求流体凝胶的制备新方法，García等[20]利用MR-D1均化器和锯齿型叶轮机械处理1 500 s获得了结冷胶流体凝胶。周倩等[21]以大豆分离蛋白和阿拉伯胶为原料，采用水浴加热同时伴以高速分散机对蛋白-多糖溶液进行搅拌剪切（700 r/min），冷却至室温后进行均质（30 000 r/min、2 min），制备了大豆蛋白/阿拉伯胶流体凝胶。Mills等[22]利用表面式换热器和针式搅拌器制备琼脂流体凝胶，Farrés等[23]则设计了一种针式剪切装置用于海藻酸钠流体凝胶的制备。在食品工业中，流体凝胶有望作为悬浮剂用于橙汁饮料、巧克力牛奶或者在半透明饮料中悬浮有色粒子。此外，结冷胶流体凝胶还有望作为饱腹剂使用于新型减肥食品中。为了进一步了解食品体系结构控制技术基本理论，需要对结冷胶流体凝胶的制备及其应用进行系统研究。结冷胶主要分为高酰基结冷胶和低酰基结冷胶（low acyl gellan gum，LAG）两种，高酰基结冷胶因为分子结构中富含酰基，会形成弹而韧的不透明凝胶，而LAG则形成硬而脆的透明凝胶[24]。由于两种凝胶特性的差别，使得LAG在食品工业中的应用更为广泛。有鉴于此，本研究以LAG为对象，利用流变仪灵敏的温度和剪切控制系统，通过热剪切法制备了结冷胶流体凝胶，并深入考察了基体质量浓度、剪切速率、降温速率、离子种类和浓度、酸条件等制备条件对LAG流体凝胶形成和微观结构的影响。研究结果不仅可为结冷胶流体凝胶在食品工业中的应用提供理论参考，还可进一步丰富食品胶体结构控制理论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Kelcogel®LAG 美国Kelco公司；葡萄糖酸-δ-内酯（glucono-δ-lactone，GDL） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；体积分数25%戊二醛水溶液 上海化学试剂采购供应站；氯化钠、氯化钙、无水乙醇、氢氧化钠、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Mars III型旋转流变仪 德国Hakke公司；电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；JZ78-1型磁力搅拌器 杭州通用电子仪表厂；DM4000B型荧光显微镜 德国徕卡公司；TM-1000型扫描电子显微镜日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 LAG溶液的配制

在室温下将适量LAG粉末加入到去离子水中，室温下溶胀24 h，于80 ℃下进行磁力搅拌，直至结冷胶粉末完全溶解形成透明、澄清的溶液，并用80 ℃去离子水补偿由于蒸发而损失的质量，并趁热加入计量的氯化钠溶液、氯化钙溶液和GDL。

1.3.2 LAG流体凝胶的制备及单因素试验

利用热剪切法使用旋转流变仪进行流体凝胶制备。夹具为直径60 mm的锥板，锥角2°，将制备好的LAG溶液放入夹具中，从80 ℃降温至－10 ℃，在降温过程中同时施加剪切作用，即可获得LAG流体凝胶。本实验制备流体凝胶时采用的剪切速率分别是0.5、1、5、10、50、100、200、300 s－1；降温速率分别是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13 ℃/min；制备的LAG流体凝胶质量浓度分别为0.002 5、0.005 0、0.007 5、0.01、0.015 g/mL和0.02 g/mL；钠离子浓度分别为10、20、30、40、50 mmol/L；钙离子浓度分别为1、2、3、4、5 mmol/L；GDL质量浓度分别为0.002 5、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06 g/mL。

在考察剪切速率的影响时，降温速率为3 ℃/min。在考察基体质量浓度影响时，降温速率为3 ℃/min，剪切速率为100 s－1。用GDL作为酸诱导剂制备酸化凝胶时，因为酸化加快了凝胶的形成，为了便于观察，制样剪切速率为10 s－1。

1.3.3 LAG流体凝胶微观结构的观察

微观结构观察参考文献[25]。本实验中的微观结构分析采用了两种方法，考察基体质量浓度、剪切速率、降温速率和离子影响时利用荧光显微镜（关闭荧光）进行观察。将制备好的LAG流体凝胶用去离子水进行稀释（稀释质量比为1∶2），滴于载玻片上进行微观结构分析。使用的目镜放大倍数为10，物镜放大倍数为100。

GDL加入后凝胶速率较快，制备好的流体凝胶无法用光学显微镜进行分析，因此采用扫描电子显微镜对其进行微观结构表征。将流体凝胶切成小块，用0.1 mol/L、pH 7.2磷酸盐缓冲液（含体积分数2.5%戊二醛）固定24 h（期间换一次固定液）。然后用pH值为7.2的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗3 次，每次15 min。用不同体积分数（50%、70%、80%、90%、95%、100%）的乙醇溶液进行梯度脱水，每次15 min。对样品进行超临界干燥，干燥后的样品进行喷金处理，并用扫描电子显微镜对样品的断面结构进行观察。

1.4 数据统计与分析

所有数据均利用Origin 8.0和SPSS 17.0软件进行数据处理和分析。为了减少实验误差，提高数据的可信度，本研究中每组实验重复测定5 次，所用数据为5 次重复测量的平均值。

2 结果与分析

2.1 LAG流体凝胶的形成

图1 LAG流体凝胶制备过程中黏度的变化曲线Fig. 1 Evolution of viscosity of LAG fl uid gel during preparation

由图1可见，整条曲线表现出反S的变化规律，与自由基聚合反应类似，黏度变化曲线也可类似地分为3 个区域，分别定义为诱导区、增速区和降速区。当温度较高时（28～80 ℃）为诱导区，此时LAG溶液的黏度很低，且随着温度的降低缓慢增大，说明此时体系为液体；当温度降低到25 ℃附近时，黏度迅速增大，在5 ℃的变化范围内，黏度从0.027 Pa·s上升至0.205 Pa·s，增大了近一个数量级，为增速区；之后当温度进一步降低至20 ℃附近时，黏度上升速率明显减小，并基本保持恒定，对应为降速区。黏度曲线说明在降温过程中，LAG体系形成了流体凝胶。

Norton等[26]认为流体凝胶制备过程中黏度的上升与体系中大分子聚集形成的凝胶核有关。黏度转变对应着体系内部流体凝胶的形成，且转变温度接近于多糖的凝胶温度。本研究中，在诱导区，随着温度的降低，结冷胶分子会出现无规线团到双螺旋构型的转变，结冷胶分子链聚集形成高分子富集区和高分子贫瘠区，体系分相在剪切力的作用下，大分子链局部规整排列，形成毛发状的凝胶核。之后在持续降温和剪切流场的共同作用下，凝胶核会发生聚集、增长，形成的粒子尺寸和数量会快速增加，因此黏度出现了快速增大，对应着曲线上的增速区。随着温度的进一步降低，凝胶粒子会逐渐达到一个平衡尺寸，体系进入降速区，黏度基本保持不变。在本研究中，把黏度开始出现快速上升的转折点对应的温度定义为转变温度。

2.2 LAG流体凝胶形成的影响因素

2.2.1 降温速率的影响

图2 降温速率对LAG流体凝胶形成的影响Fig. 2 Effect of cooling rate on the formation of LAG fl uid gels with different low acyl gellan concentrations

由图2可见，在确定的基体质量浓度下，降温速率越大，转变温度越低，当降温速率增大至某一临界值后，转变温度则基本保持恒定不变。这可能是因为结冷胶溶液在降温过程中会出现凝胶化现象，降温速率越快，每个温度下持续的时间越短，结冷胶高分子链段来不及运动，使得流体凝胶的转变温度趋于一个定值。临界降温速率与LAG质量浓度密切相关，对LAG质量浓度为0.005 g/mL的体系而言，临界降温速率为9 ℃/min；基体质量浓度为0.01 g/mL时，临界降温速率为6 ℃/min；而当基体质量浓度增大至0.015 g/mL时，临界降温速率则降低为4 ℃/min。说明基体质量浓度越大，影响转变温度的临界降温速率越小，这可能是因为基体质量浓度越大，单位体积内的结冷胶分子链越多，分子链的松弛和移动越困难造成的。此外，流体凝胶的黏度随着降温速率的增大而略有增加，这和Gabriele等[13]对κ-卡拉胶流体凝胶的研究结果不一致，Gabriele等发现降温速率越大，κ-卡拉胶流体凝胶的黏度稍有降低，其认为在流体凝胶形成期间降温速率较低，流体凝胶经历的时间较长，形成的凝胶颗粒之间形成桥接的可能性越大，黏度就越大。本研究中认为在结冷胶溶液中，降温速率越快，分子链的聚集形成凝胶核的尺寸越大，使得最终黏度越大。

2.2.2 基体质量浓度的影响

图3 基体质量浓度对LAG流体凝胶形成的影响Fig. 3 Effect of matrix concentration on the formation of LAG LAG fl uid gels

由图3可知，基体质量浓度越大，体系的转变温度越高，形成流体凝胶后的黏度也越大，这和降温速率对LAG流体凝胶影响的研究结果一致。造成该现象的原因可能是因为基体质量浓度越大，单位体积内结冷胶分子链的数量越多，分子之间发生彼此碰撞的机率增大，大分子链之间的相互作用增强，结构有序化 程度增大。当基体质量浓度从0.002 5 g/mL增加至0.02 g/mL时，LAG流体凝胶形成后的黏度从0.06 Pa·s增大至1.50 Pa·s。Mao Runsheng等[27]在对结冷胶静态凝胶研究中发现，基体质量浓度越高，结冷胶静态凝胶的凝胶强度也越大，这与本实验对结冷胶流体凝胶的研究结果一致。

研究还发现LAG流体凝胶形成后的黏度（η）与基体质量浓度（ρ）之间的关系符合指数关系（式（1））。

图4给出了方程（1）的拟合结果，显然，基体质量浓度与流体凝胶最终黏度之间的关系可以很好地用该方程进行拟合。由图4可知，基体质量浓度增加至一定值后，质量浓度改变对流体凝胶最终黏度的影响会愈加明显，这是因为当结冷胶质量浓度很低时（低于0.01 g/mL），单位体积内结冷胶分子链的数量较少，分子链之间形成的有效连接较少，且这种连接很容易被剪切作用所破坏。当基体质量浓度较大时，单位体积内大分子链较多，容易缠绕形成有序结构，质量浓度越高，相互作用越强，越容易抵抗剪切流场的破坏作用。

图4 LAG流体凝胶浓度与黏度之间的关系Fig. 4 Viscosity versus matrix concentration curve of LAG fl uid gels

2.2.3 剪切速率的影响

图5 剪切速率对LAG流体凝胶形成的影响Fig. 5 Effect of shear rate on the formation of LAG fl uid gels

由图5可知，当温度降低至25 ℃附近时，所有体系的黏度均出现了急剧增加，这个温度和LAG的凝胶温度比较接近（约27 ℃），可见，剪切速率对流体凝胶的转变温度几乎没有影响，但会影响流体凝胶的最终黏度。剪切速率越大，LAG流体凝胶的最终黏度越低，这是因为剪切速率增加，流体凝胶粒子会产生流动，粒子表面变得更加光滑，阻碍了粒子间的相互作用和进一步聚集，这和Bradbeer等[24]的研究结果类似。现有研究表明，结冷胶凝胶时会出现无规线团向双螺旋构型的转变，之后双螺旋构型会进一步聚集形成三维网络结构。在剪切流场作用下，当温度降低到结冷胶的凝胶转变温度以下时，凝胶网络结构的形成和剪切力的破坏作用出现了动态竞争，竞争的结果决定了凝胶粒子间的相互作用和流体凝胶的最终性能。剪切速率、降温速率等因素会影响构象取向动力学，并最终影响了流体凝胶的黏弹行为。

Emanuele等[28]研究发现0.005 g/mL的琼脂溶液黏度的增加量和剪切速率之间符合指数关系，且指数为－0.85。本研究中发现，0.01 g/mL的LAG流体凝胶形成后的最终黏度η与剪切速率 之间符合式（2），拟合结果如图6所示，这也和Emanuele等的研究结果类似。

图6 LAG流体凝胶形成后的最终黏度与剪切速率之间的关系曲线Fig. 6 Final viscosity of LAG fl uid gels versus shear rate

2.2.4 离子浓度的影响

图7 钠离子（a）和钙离子（b）浓度对LAG流体凝胶形成的影响Fig. 7 Effect of sodium concentration (a) and calcium concentration (b)on the formation of LAG fl uid gels

由图7可知，显然离子浓度越高，体系的转变温度越高，流体凝胶的最终黏度也越大，说明离子的添加促进了流体凝胶的形成。这是因为阳离子对结冷胶分子链上的羧基具有静电屏蔽作用，离子浓度升高会促进结冷胶分子链之间的聚集[29]。对比钙离子和钠离子，可以发现，钙离子诱导流体凝胶的最终黏度更大。这要归因于离子种类不同诱导凝胶机理不同，一价钠离子与结冷胶双螺旋之间通过水分子建立间接的连接（羧基-钠离子-水分子-钠离子-羧基），而二价钙离子与结冷胶双螺旋之间直接建立羧基-钙离子-羧基的连接，二价钙离子直接桥连的方式更能促进结冷胶双螺旋聚集形成凝胶，所以钙离子形成的LAG流体凝胶的黏度更大，这和结冷胶基静态凝胶的研究结果[30-31]一致。

2.2.5 GDL质量浓度的影响

GDL易溶于水且会水解生成葡萄糖酸，在研究中经常用其作为酸诱导剂考察酸性凝胶的凝胶特性，本研究选取GDL作为酸诱导剂考察了酸性条件对流体凝胶的影响。

图8 GDL质量浓度对LAG流体凝胶形成的影响Fig. 8 Effect of GDL concentration on the formation of LAG fl uid gels

由图8可知，当GDL质量浓度为0.01 g/mL时，高温区体系黏度很小且保持平衡，当温度降至某个临界值时，体系的黏度会迅速升高，之后当温度进一步降低时，黏度增加的趋势变缓且基本维持定值。当GDL质量浓度高于0.02 g/mL时，在低温区域流体凝胶的黏度会随着温度的降低出现缓慢升高，且GDL质量浓度越高，这种升高现象越明显。GDL质量浓度越大，体系的转变温度越高，流体凝胶的最终黏度也越大，这是因为GDL质量浓度越高，酸化速率越快，越容易促进LAG流体凝胶的形成[32]，这也与本实验室前期对结冷胶酸化静态凝胶的研究结果类似[33]。

2.3 LAG流体凝胶的微观结构

图9 制备条件对LAG流体凝胶微观结构的影响Fig. 9 Effect of preparation conditions on microstructure of LAG fl uid gels

由图9可知，基体质量浓度较低（0.005 g/mL）时，流体凝胶颗粒为球形，粒径1～2 μm，当基体质量浓度增加到0.010 g/mL时，凝胶颗粒逐渐增大，形状变得不规则，且分散度也增大。增大降温速率和减小剪切速率对流体凝胶粒径尺寸的影响是等效的，即要得到粒径小且分布均匀的流体凝胶粒子，需要增大剪切速率或者降低降温速率。Moakes等[15]对乳清蛋白流体凝胶研究时发现，低剪切速率下，流体凝胶的粒径大于120 μm，在高剪切速率下，流体凝胶的粒径小于40 μm，即剪切速率越大，形成的聚集体的尺寸越小，这和本研究结果一致。离子浓度增加会使得流体凝胶颗粒增大、规整度下降，形状会从球形变为棒状。随着GDL质量浓度的升高，流体凝胶的质地逐渐变得疏松，这可能是因为LAG流体凝胶在形成时体系同时发生了剪切破坏和有序化结构的形成，最终结构取决于二者的竞争作用，GDL质量浓度越高，酸化速率越快，结冷胶分子链的聚集加剧，剪切作用不足以破坏形成的聚集体，故而越不容易形成均匀的凝胶结构。

结合流体凝胶在制备过程中的流动行为，不难发现，降温速率越高，剪切速率越小、基体质量浓度越大，流体凝胶的最终黏度也越大，形成的凝胶粒子粒径也越大，但不规则度也变大，说明流体凝胶的黏度对其微观结构变化具有灵敏的响应，与Mahdi等[34]的研究结果一致。

3 结 论

LAG溶液在降温和剪切流场的共同作用下形成了流体凝胶，体系的黏度-温度关系呈现反S曲线，流体凝胶的形成可以分为诱导区、增速区和降速区。

流体凝胶的形成取决于制备条件。基体质量浓度越高，转变温度越高，形成的流体凝胶的黏度、颗粒尺寸和不规整度增大。LAG流体凝胶的黏度（η）与基体质量浓度（ρ）之间的关系符合指数关系η＝3 316.6ρ1.97。增大剪切速率和减小降温速率等效，要得到粒径小且分布均匀的流体凝胶粒子，需要增大剪切速率或者降低降温速率。凝胶形成后的最终黏度（η）与剪切速率（）之间符合η＝18.56－0.96。

离子的浓度越高，体系的转变温度越高，流体凝胶的最终黏度越大，相对于钠离子，钙离子诱导流体凝胶的最终黏度更大。酸化条件也会影响流体凝胶的形成，GDL质量浓度越高，体系转变温度越高，流体凝胶黏度越大，质地则越疏松。流体凝胶颗粒粒径越大，形成的流体凝胶的最终黏度也越大。