急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p表达与心肌损伤的相关性

马淑慧，徐进

（河南省信阳市中心医院检验科免疫室，河南 信阳 464000）

急性心肌梗死其基础病变通常为冠状动脉粥样斑块形成,在动脉粥样斑块形成过程中反复发生血栓形成、心肌细胞缺氧缺血损伤病理改变，最终导致冠脉完全阻塞发生心肌缺血坏死[1]。目前评估心肌损伤的实验室指标有传统血清学标志物如血清肌红蛋白、肌酸激酶 （CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、心肌肌钙蛋白（cT-nI/T）等，都是急性心肌梗死患者心肌损伤标志物,尤其是cTnI/T的使用被认为是金标准[2-4]。这些标志物均有其局限，如特异度低、在慢性肾病与充血性心力衰竭患者中也有高表达等。近来有研究报道，miRNAs在急性心肌梗死患者血内表达明显升高,有望成为急性心肌梗死新型标志物[5]。miR-12 6-5p能够通过对内皮细胞活化与白细胞转运机制的调控影响血管内皮功能,可能参与了急性心肌梗死的心肌损伤过程[6]。本研究观察急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p及各主要心肌损伤标志物表达情况，分析患者外周血miR-126-5p表达与其心肌损伤的相关性,为未来急性心肌梗死患者心肌损伤的早期评估与治疗提供新的标志物。

1 材料与方法

1.1 纳入对象 选择2018年2月至2019年8月期间我院收治的31例急性心肌梗死患者，为心肌梗死组；不稳定性心绞痛患者30例,为不稳定性心绞痛组；稳定性心绞痛患者30例,为稳定性心绞痛组；接受健康检查的35例健康人,为健康对照组。急性心肌梗死患者符合 《急性心肌梗死诊断和治疗指南》[7]中相关诊断标准；稳定型心绞痛患者符合《慢性稳定型心绞痛诊断和治疗指南》[8]中相关诊断标准；不稳定型心绞痛患者符合《不稳定性心绞痛和非ST段抬高心肌梗死诊断与治疗指南》[9]中相关诊断标准。健康对照组人群均为既往无心血管病史且经健康体检证实为身体健康的人群。排除：⑴既往有心肌病、心力衰竭、急性心肌梗死、高血压性心脏病、肥厚性心脏病等心脏病病史者；⑵合并肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤疾病者；⑶合并慢性或急性肾功能不全者；⑷既往接受肾脏移植替代治疗者；⑸近期内有外伤史、出血史与重大手术治疗史者；⑹合并自身免疫性疾病、骨骼肌损伤等患者；⑺合并肺部慢性疾病或身体严重感染者。本研究的实施获得医院伦理委员会批准同意，并签署知情同意书。

1.2 一般资料 急性心肌梗死组患者男性19例，女性 12 例；年龄 40～70 岁,平均（58.25±5.12）岁；体质量 44～85kg，平均（60.24±8.59）kg。 不稳定性心绞痛组男性 18例,女性 12例；年龄 41～70岁,平均（59.11±6.02）岁；体质量 45～85kg，平均（61.02±8.61）kg。稳定型心绞痛组男性17例，女性13例；年龄 40～72 岁,平均（60.01±5.17）;体质量 44～86kg，平均（61.59±8.71）kg。 健康对照组男性 21例，女性14 例；年龄 39～71 岁，平均（59.69±5.45）岁；体质量45～84kg，平均（60.32±7.17）kg。 4 组纳入者性别、年龄、体质量等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3 主要仪器与试剂 CK、CK-MB、LDH、cTnI试剂盒生产商为贝克曼库尔特公司。乙二胺四乙酸(EDTA)生产商为Sigma-aldrich公司、RNA逆转录试剂盒生产商为Takara公司、DEPC生产商为赛默飞世尔科技有限公司;生化仪生产商为贝克曼库尔特公司、免疫测定仪生产商为贝克曼库尔特公司；总RNA提取试剂（Trizol）生产商为青岛捷世康生物科技有限公司;线虫cel-mir-39生产商为英国biorbyt；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ生产商为日本Takara公司；实时聚合酶链反应仪生产商为美国Bio-rad公司。

1.4 测定方法

1.4.1 心肌损伤血清标志物含量测定 采集入组者晨起时空腹状态下外周静脉血,采集1管5mL血样本至抗凝管内，1份5min血样本至干燥管（非抗凝管）内，抗凝管内血样本经处理得到血浆，非抗凝管内样本经处理得到血清。采用酶法检测CK、CK-MB、LDH水平。血清cTnI含量采用免疫比浊法测定。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.2 外周血miR-126-5p表达测定 ⑴血浆microRNA的提取：向血浆(250μl)内加入TRIzol 750 μl,振荡混匀保证蛋白复合物被完全解离，振荡前各样品内加入线虫cel-mir-39 50pm作为内部参照。混合物内加入氯仿200μl，充分振荡室温下静置 10min，在 12000r/min、4℃，离心 10min，离心后取上清液,将离心后所得全部上清液(多少体积？)转移至新的装有3μl糖原+600μl异丙醇的试管内。将混合的溶液置于零下20℃条件下过夜。12000r/min、4℃离心10min，弃上清，用95%酒精溶液反复清洗沉淀物，后加入DEPC 10μl混匀备用。⑵测定血浆microRNA浓度:取1μl RNA样品，核酸蛋白分析仪检测RNA浓度,测量并记录A260，A260/A280，RNA浓度,对测量异常过高或过低的，再次测量并核对，剔除异常值，其他样本存储在-80℃环境下待检（进行逆转录）。⑶多聚腺苷酸化及逆转录。⑷microRNA定量检测：配备20μl反应体系,反应体系的配备：7.2μl ddH2O，10μl SYBR （Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit） （2X），0.4μl miRNA特异性引物的3，引物，0.4μl辅酶Q引物和2.0μl cDNA。使用实时聚合酶链反应仪进行miR-126-5p相对表达水平测定,聚合酶链反应条件：预变性：95℃，10s，1次循环；聚合酶链反应：95℃，10s，60℃，20s，39 次循环； 溶解：95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s，1 次循环。

1.5 统计学方法 本文数据均采用SPSS 20.0软件检测分析，采用“χ2”检验、t检验，用“[n（%）]”表示计数资料，使用均数标准差“（x±s）”表示计量资料（全部数据均经正态分布检验），外周血miR126-5p相对表达与各心肌损伤标志物水平的相关性，采用双变量Pearson直线相关检验，P＜0.05为两组数据对比差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组血清CK、CK-MB、LDH、cTnI水平比较 4组中,血清 CK、CK-MB、LDH、cTnI水平由低至高依次为健康对照组人群、稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组、急性心肌梗死组，健康对照组与稳定性心绞痛组各指标水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；其他各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 1。

表 1 4 组血清 CK、CK-MB、LDH、cTnI水平比较（x±s）

2.2 4组血清miR-126-5p相对表达比较 4组中，血清miR-126-5p相对表达由低至高依次为健康对照组人群、稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组、急性心肌梗死组，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 见表 2。

表2 4组血清miR-126-5p相对表达比较

2.3 外周血miR-126-5P相关表达与心肌损伤各标志物水平相关性分析 经双变量Pearson相关性分析结果显示,急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p相对表达与患者血清各心肌损伤标志物水平均呈显著正相关（r＞0，P＜0.05）。 提示外周血 miR-126-5p表达量可反映患者心肌损伤的程度。见表3。

表3 外周血miR-126-5P相关表达与心肌损伤各标志物水平相关性分析

3 讨论

在发生缺氧缺血损伤时,心肌细胞内酶与相关结构分子会释放到血液循环中,成为可以反映心肌损伤程度评估的标志物。CK、LDH、AST等是广泛存在于心肌、骨骼肌细胞和平滑肌细胞中，在一定程度上可以用于判断心肌损伤程度,但其特异性相对较差[12]。CK-MB与cTnI二者是心肌细胞重要分子,用于评估机体心肌损伤有着较好的特异度[13]。CK-MB是催化酶的一类,参与了心肌细胞的能量代谢；cTnI则是结构分子，是确保心肌细胞结构完整性的重要蛋白[14,15]。临床应用显示，测定上述心肌损伤标志物的水平可用于评价心肌损伤程度。本研究分析了健康对照者、冠心病不同病情发展者与急性心肌梗死患者发病期间心肌损伤血清学标志物水平表达,结果随心肌缺血损伤严重程度升高，CK、CK-MB、LDH、cTnI血清水平表达明显升高。

图1 健康对照组cTnI正态性检验Q-Q图

近几年，随着多组学研究的飞速发展，发现了众多新疾病分子生物标志物。miRNAs是一类单链的、短的、非编码蛋白RNA分子，经部分互补匹配至目的靶点3′非编码区,来调节基因水平表达[18]。许多miRNAs已经被证实在细胞周期增殖、调控、存活、分化、转移等过程中发挥重要作用。有研究证实，miR-126-5p通过对内皮细胞活化与白细胞转运机制的调控影响血管内皮功能,可能参与了急性心肌梗死的心肌损伤过程[19]，急性心肌梗死患者的心肌损伤可能与miRNAs存在一定联系。有研究报道，急性心肌梗死患者miR-126-5p表达水平较健康人群显著升高,与疾病之间表现出明显的相关性[20]。本研究结果显示，4组中健康对照组外周血miR-126-5p相对表达最低，心肌缺血患者随病情严重程度上升，miR-126-5p血水平越来越高，以急性心肌梗死组最显著，且miR-126-5p相对表达水平与血液中上述心肌损伤标志物均呈正相关。提示外周血miR-126-5p表达的异常升高与心肌缺血损伤的严重程度相关；miR-126-5p表达可能作为一种新的标志物用于评估急性心肌梗死患者心肌损伤程度。本研究纳入样本量相对较小，结论可靠性还应在未来进一步展开大样本的研究加以验证。

综上所述,急性心肌梗死患者外周血miR-126-5p表达与其心肌损伤明显相关,在临床诊疗实践中可考虑将miR-126-5p表达用于评估和预测冠心病患者心肌损伤程度。