HCV RNA定量检测系统性能验证方案的制定

廖威，方丽娟，邓旭怡，罗小琴，雷春洪，王刚

（江西迪安华星医学检验实验室，江西 南昌 330096）

检测系统的分析性能验证是临床检验质量管理 的 重 要 内 容 。 CNAS-CL02：2012 （ISO15189：2012IDT）[1]指出，在常规应用前，应由实验室对未加修改而使用的已确认的检验程序进行独立验证。验证过程证实的检验程序的性能指标，应与检验结果的预期用途相关。CNAS-CL02-A009[2]指出，定量检测方法和程序的分析性能验证内容至少包括精密度、正确度、线性范围、抗干扰能力等验证。正常健康人体内不含HCV-RNA，所以检出限的验证也是重要的验证环节。本实验室HCV-RNA定量检测系统使用磁珠法提取核酸,提取效率较柱抽提法高[3]。由于PCR检测项目相对其他专业的检测项目来说，验证的标本获取相对困难，且验证内容和验证方法不完全一致。本文以CNAS文件和中华人民共和国卫生行业标准颁布的系列文件为依据,对新使用的HCV-RNA定量检测系统进行性能验证，评估并分析其临床应用价值。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 HCV-RNA低值S5和高值S3标准物质来自北京康彻斯坦生物技术有限公司；2017年和2018年卫生部临床检验中心室间质评标本，共 10 份,编号为：201721～201725、201811～201815；HCV-RNA高值阳性血清为本实验室收集的高浓度临床阳性标本；HCV-RNA阴性血清为本实验室收集的已证实肝功能、乙肝两对半、丙肝抗体和HCV RNA全为阴性的体检标本。所有标本于-70℃冰箱保存。

1.2 仪器与试剂 美国ABI7500荧光定量PCR仪,湖南圣湘生物科技有限公司丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）,批号2018001。

1.3 实验方法

1.3.1 精密度验证 参照WS/T 492-2016[4]文件。将HCV-RNA高浓度阳性标本进行10倍梯度稀释至浓度范围 为106 IU/ml和103 IU/ml的高低两个浓度水平，每天分析一个批次，每个水平重复测定4次，连续测定5d，每个水平累计得到20个数据。计算批内精密度(CV批内)和总精密度(CV批总)。

1.3.2 标本携带污染验证 使用HCV-RNA高浓度阳性标本44例、阴性标本44例，交叉排列。同时提取、扩增，验证检测系统抗污染能力。要求阴性血清检测结果仍为阴性，则验证通过。

1.3.3 正确度验证 检测卫生部临床检验中心2017年和2018年全国室间质评活动的标本10个（编号为：201721～201725；201811～201815）,按照国家卫生部临床检验中心的判断标准,要求结果落在靶值±0.4 Log值为符合要求,10个标本至少8个符合要求为验证通过。

1.3.4 分析测量范围验证 参照WS/T 420-2013[5]文件。将HCV-RNA高浓度阳性标本用阴性血清进行系列 10 倍梯度稀释（1：10、1：100、1：1000…）至试剂说明书声明的分析测量范围下限,将高浓度阳性标本和所有稀释度标本在同一批检测,每个浓度标本重复测量3次，计算测定Log值和预测Log值进行线性回归分析,要求b在1±0.05范围内，a接近于0，R2≧0.95，且测定Log值和理论Log值的差值≦±0.4 Log值，则验证通过。

1.3.5 定量限和检出限 参照WS/T 514-2017[6]文件。使用阴性血清将康彻斯坦标准物质：2.2*103 IU/ml（对数值为3.34）稀释至2次方的浓度值，然后再进行5个梯度的倍比稀释,对稀释后的标本每天分析一个批次，每个稀释度重复检测7次，连续测定3天，每个水平累计得到21个数据，并得出检出和未检出两种情况，如检出，则根据浓度值的对数值求出均值、SD和CV,选择CV小于允许精密度要求的稀释度时的最低浓度作为定量限。当检出结果比例大于或等于95%时的稀释度浓度，则为检出限。或检测生产企业声称浓度值的样本25次，至少22次检出，则为检出限[7]。

1.3.6 特异性验证 使用试剂盒对实验室已确证的HCV-RNA阴性但甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒(HBV)、梅毒螺旋体（CT）、巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EB）、单纯疱疹病毒（HSV）阳性标本进行HCV-RNA检测，检测结果为阴性则符合要求。

1.3.7 抗干扰能力验证 使用接近或高于厂家声明浓度的胆红素、血红蛋白、甘油三酯和总IgG的HCV-RNA阴性样本，10倍稀释外观正常的高浓度HCV-RNA标本，重复检测稀释后的标本5次，HCV-RNA测定均值与预期值的偏倚应在±0.4 Log值范围内。原始高浓度HCV-RNA标本用正常阴性血清稀释复测3次的Log均值作为预期值。

1.4 统计学方法 采用Excel 2007软件对批内精密度、总精密度、抗干扰试验、正确度、分析测量范围、检出限、定量限及特异性结果进行统计。

2 结果

2.1 精密度验证结果 低浓度和高浓度标本的批内精密度和总精密度均≤5%，符合厂家声明。见表1。

2.2 标本携带污染验证结果 将高浓度阳性标本和阴性标本共88个进行穿插排列,同时提取和PC R扩增，阴性结果全为阴性，均无交叉污染。见表2。

表1 精密度试验结果

表2 标本携带污染验证结果

2.3 正确度验证结果 采用卫生部临床检验中心室间质评标本（编号： 201721～201725、201811～201 815）评估正确度，全部通过，正确度符合要求。见表3。

表3 正确度验证结果

表4 分析测量范围验证结果

2.4 分析测量范围验证结果 实验室收集到的最高浓度标本为1.98×107IU/ml，对其进行系列10倍梯度稀释至19.8IU/ml，验证的分析测量范围为（19.8～1.98×107）IU/ml， 厂家声明的分析测量范围为（50～1×108）IU/ml，验证通过。 见表 4、图 1。

2.5 定量限和检出限验证 厂家声明的定量限为50 IU/ml，Log值为1.70，按照卫生部临床检验中心室间质评的判断标准，TEa在±0.4的范围内可接受，则在该浓度的TEa为23.5%,参照CNAS-CL 02-A009附录A,在定量限浓度处的精密度允许范围为4/5 TEa（18.8%）。标准品经过稀释后接近定量限时的浓度为55 IU/ml，Log值为1.74,正确度在允许范围（1.34～2.14）内。验证的定量限实测浓度的Log均值为1.51，CV为16.06%，精密度也在允许范围内，定量限验证通过。厂家声明的检出限为25 IU/ml,在浓度值为22.5 IU/ml时，21次检测中检出20次，检出结果大于95%，检出限验证也通过。见表5。

图1 分析测量范围验证回归曲线

表5 定量限和检出限验证结果

2.6 特异性验证结果 HCV-RNA检测试剂盒与甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒（HBV）、梅毒螺旋体（CT）、巨细胞病毒（CMV）、EB 病毒（EB）、单纯疱疹病毒（HSV）病原体感染的标本无交叉反应，特异性符合要求。见表6。

表6 特异性验证结果

2.7 抗干扰能力验证结果 高胆红素（550mmol/L）、高血红蛋白（23g/L）、高甘油三酯（40mmol/L）和总IgG（45g/L）对检测结果的影响在允许的偏倚范围内，符合厂家声明。见表7。

3 讨论

丙型肝炎呈全球性流行,据世界卫生组织统计（2014）,全球HCV的感染率约为2.8%,估计约1.85亿人感染HCV，其中约1.5亿为慢性感染，每年因HCV感染导致的死亡病例约35万例。但由于HCV感染具有隐匿性,多数感染者并不知道感染HCV。暴露于HCV后1～3周，在外周血可检测到HCV RNA。HCV RNA定量检测主要用来检测HCV在血液中的含量，适用于HCV现症感染的确认、抗病毒治疗前基线病毒载量分析、以及抗病毒治疗过程中及治疗后的应答评估[8]。无论急性还是慢性丙型肝炎病毒感染，确诊均有赖于HCV RNA的检测,并由于丙肝患者在应用聚乙二醇干扰素联合RBV治疗方案时，高灵敏的HCV-RNA检测试剂有助于更准确鉴定RVR,从而为确定抗病毒治疗疗程提供更可靠的依据[8，9]。由此可见，HCV RNA定量检测对于临床丙型肝炎的诊治具有重要的意义。

表7 抗干扰能力验证结果

本文的HCV RNA定量检测系统，使用的是湖南圣湘的检测试剂,厂家的说明书中明确说明了使用ABI7500荧光定量PCR分析仪进行扩增的程序，并提供了该检测系统对应的产品性能指标。对于此类厂家能够提供完整产品性能指标的检测系统，可以当做封闭系统来对待，只需要对检测系统做基本的性能验证实验即可,无需进行更加繁琐的性能确认实验。CNAS文件明确指出分子诊断领域定量检测方法和程序的分析性能验证内容，中国人民共和国卫生行业标准等对各性能指标的验证方法提供了具体的实验方案,本文旨在对本实验室的HCV RNA定量检测系统进行性能验证，为PCR定量方法学的性能验证提供方案。具体验证内容包括精密度、标本携带污染、正确度、分析测量范围、检出限和定量限、特异性以及抗干扰能力。由于PCR定量项目的数据呈偏态分布,在进行实验数据统计时,均将初始浓度转化成对数值进行统计。毕波和吕元的文章[10]指出，不同检测项目应选择不同的方法学验证实验,对于低值特别有意义的检测项目，必须进行功能灵敏度的验证实验，也就是本文中所进行的检出限和定量限验证，由于HCV RNA属于病原体微生物，在正常人体内不含有，所以微量的病毒检出具有重要的临床意义。毕波和吕元的文章中还指出,检测系统良好的精密度和无标本携带污染是进行其他验证实验的前提，然后再进行正确度验证，最后可依次进行最大稀释度验证、功能灵敏度验证实验和分析测量范围验证实验，本文的验证实验顺序跟其基本一致。精密度验证方案本研究参考的是WS/T 492-2016[4]。通过对接近厂家声明的线性范围上限的高浓度标本（1.98×107IU/ml）进行 10倍梯度稀释，获得一系列的等比稀释后的标本,使用6次方的高值标本和3次方的低值标本进行精密度验证,其他系列浓度的样本和精密度验证后多余的样本于-70℃冰箱保存，用于分析测量范围验证。所有样本避免反复冻融，保证样本的稳定性。

标本携带污染验证使用的临床收集到的不同浓度的高值标本和阴性血清，高浓度样本和阴性样本各44份，交叉排列，外加1个阴性对照、1个阳性对照、高低浓度2个质控品和4个标准品，共96孔，布满整版，保证每孔均被验证。

WS/T 492-2016 和 WS/T 420-2013[4，5]均指出，可以使用患者样本与其他检验方法比较进行正确度验证实验,也可以使用参考物质进行正确度验证实验。若使用参考物质进行正确度验证实验，可以选择大型能力比对或室间质评的样本。本文选择的是使用卫生部临床检验中心2017年和2018年下发的2次共10个样本进行验证，正确度符合要求。

厂家声明的分析测量范围为50～108IU/ml。依据WS/T 420-2013[5]中线性验证相关内容,结合WS/T 408-2012[11]和相关文献[12-14]，本方案中选用的上限标本浓度为1.98×107IU/ml,下限标本选用阴性血清，验证得到的分析测量范围为（19.8～1.98×107）IU/ml，符合厂家声明。

定量限指满足声明的精密度和正确度,在声明的实验条件下能够可靠定量的分析物的最低浓度。WS/T 514-2017指出，最简单的检测限试验设计应包括一个试剂批号；一个仪器系统；3天实验；2个LoD和LoQ声明浓度附近的标本;总计至少2 0个重复检测结果[6]。本文正是以此制定实验方案,通过正确度和精密度的结果综合判断定量限。定量限的精密度要求是根据厂家说明的定量限浓度、CNAS-CL02-A009文件附录A和卫生部临床检验中心室间质评的判断标准计算得出,为18.8%,与应葳,李万春,宋涛，等人的文章[12]中说明的20%接近。通过验证表明，本实验室HCV RNA检测系统的定量限为55 IU/ml，接近厂家声明。检出限为22.5 IU/ml，小于厂家声明。说明验证的定量限和检出限均符合厂家声明。

依据国家食品药品监督管理总局发布的 《丙型肝炎病毒核酸测定试剂技术审查指导原则》[15]，推荐用于特异性研究的微生物包括HCMV、EBV、HSV2等13种,推荐用于干扰研究的物质包括胆红素、血红蛋白和甘油三酯等7种，其中胆红素、血红蛋白和甘油三酯为必须验证的干扰物质。由于各类阳性病原微生物难以获得,本实验选择甲型肝炎病毒（HAV）、乙肝肝炎病毒（HBV）、梅毒螺旋体（CT）、巨细胞病毒（CMV）、EB 病毒（EB）、单纯疱疹病毒（HSV）6种病毒进行交叉反应的验证，使用总胆红素（550 mmol/L）、血红蛋白（23 g/L）、甘油三酯（40 mmol/L）和总 IgG（45 g/L）4 种临床常见的干扰物质进行验证，均符合要求。

通过以上验证结果表明,在高低值分别为6次方和3次方浓度时的批内精密度和总精密度均符合要求；无标本携带污染；正确度符合卫生部临床检验中心室间质量评价要求；在50～108IU/ml分析测量范围内线性良好;检出限和定量限符合厂家声明；特异性验证通过；高浓度的血红蛋白、胆红素、总IgG和甘油三酯均对试验无明显干扰。综上所述，本文建立的HCV RNA定量检测系统的性能验证方案合理,验证的各项性能指标均符合厂家声明，适用于临床检测。