多参数流式细胞术在AML1/ETO阳性急性髓系白血病诊断中的应用研究

江梅 ，郭海燕 ，聂益军 ，吕小林 ，万腊根 ，张长林

（1.南昌大学第一附属医院检验科；2.南昌大学第一附属医院病理科，江西 南昌 330006）

AML1/ETO融合基因阳性的急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）占所有 AML 的 5%~10%[1-6]。2001年世界卫生组织（WHO）将 t(8;21)(q22;q22),AML1/ETO融合基因阳性的AML列为独立亚型,美国NCCN指南将此亚型归为预后良好组，当伴有c-KIT突变视为预后中危组[7]。而且也有相关文献报道AML1/ETO融合基因阳性的AML完全缓解率高达96%~98%，5年总生存期接近70%，无病生存期超过35个月[8-11]。多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry，MFCM）以其快速、高通量且对标本要求低等特点，已广泛应用于血液肿瘤诊断、分型及预后判断。鉴于此,本研究旨在探讨MFCM在AML1/ETO融合基因阳性的AML诊断中的应用价值以及分析AML1/ETO融合基因阳性患者的骨髓细胞免疫表型,为病人早期诊断、分型和预后分层提供依据。

1 材料和方法

1.1 病例资料 2010年1月至2018年1月期间在我院收治初诊的44例经细胞遗传学或分子遗传学检测AML1/ETO阳性AML患者以及44例AML1/ETO阴性患者，其中男性54例，女性34例，中位年龄45（9~71）岁，所有患者均于治疗前同时作骨髓细胞形态学、MFCM、细胞遗传学或分子遗传学检查。AML诊断参照世界卫生组织WHO2016[12]。

1.2 骨髓细胞形态学检测 AML诊断及分型参照FAB标准[13]。骨髓细胞形态学诊断AML-M2b(对应WHO分型中的AML伴AML1/ETO)或提示AML1/ETO阳性患者的骨髓象主要特点为原始粒细胞及早幼粒细胞明显增多,以异常中性中幼粒细胞为主，≥30%（NEC）,异常中性中幼粒细胞形态学特点是胞核与胞质发育极不平衡,核染色质细致疏松，核仁大而明显，胞质丰富，含多量细小粉红色中性颗粒，呈弥散分布,常见空泡和双层胞质，内胞质量多，呈粉红色，外胞质量少，呈浅蓝色，且呈伪足状。

1.3 MFCM检测 应用Beckman coulter FC500流式细胞仪检测骨髓细胞的免疫表型，检测FITC标记的 CD2，CD7，HLA-DR 和 cMPO，PE 标 记 的CD13,CD19,CD117和 cCD79a，ECD标记的 CD34,CD14原CD20,以及cCD3,PC5标记的CD10,CD15,CD33以及 PC7标记 CD45。每管至少分析 10000个细胞。阳性界值根据同型对照以及内对照来设定，膜表面抗原阳性率大于20%判断为阳性[14]，胞浆抗原阳性率大于10%判断为阳性[15]。

1.4 细胞遗传学检测

1.4.1 染色体核型分析 取骨髓液2 ml,肝素抗凝，有核细胞计数后按 (1～2)×106/ml进行直接法和RPMI-1640培养液短期培养法制备染色体并采用G显带技术进行核型分析,分析至少20个分裂相细胞。染色体核型描述按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2005)》。

1.4.2 荧光原位杂交（FISH)检测 AML1/ETO融合基因双色双融合探针 (DCDF)购自美国Vysis公司。按试剂盒提供的 FISH操作说明进行样本处理、变性、杂交后洗脱等操作,在日本 Olympus BX5 1荧光显微镜下通过三色滤光镜观察杂交信号，AML1/ETO融合基因阴性的细胞可见2红与 2绿分离杂交信号(2R2G)，典型AML1/ETO融合基因阳性细胞为 1红 1绿 2黄((1R1G2F)，每份样本计数至少200个细胞,并记录杂交信号及统计各信号的百分率。

1.5 分子遗传学检测 采用RT-PCR检测AML1/ETO,取肝素抗凝骨髓,提取单个核细胞,提取RNA后进行RT-PCR，具体方法见文献[16]。

1.6 统计学处理诊断性试验四格表资料分析。

2 结果

2.1 骨髓细胞形态学检测 44例AML1/ETO阳性患者中，骨髓细胞形态学FAB分型为AML-M5病人17例，AML-M2及AML-M2a病人15例，AMLM2b及提示AML1/ETO阳性 11例，AML-M4病人1例，各个亚型所占比例见图1。

2.2 MFCM检测 44例AML1/ETO阳性患者中多参数流式细胞术诊断AML1/ETO阳性患者36例，未能诊断的患者8例,流式细胞术免疫表型分析44例患者均表达CD117、CD34、CD33以及 HLADR，43例表达 CD13 （阳性率为 97.73%），42例（95.45%）患者表达CD19，且CD117和CD34为强表达，CD19 为部分表达。 CD117、CD34、HLA-DR以及CD19的共表达率高达95.45%。而在44例AML1/ETO阴性患者中，均无此表型特点。AML1/ETO阳性的AML患者免疫表型见表1。

图1 AML1/ETO阳性患者FAB分型各亚型所占比列

表1 AML1/ETO阳性的AML患者免疫表型特点

2.3 骨髓细胞形态学和MFCM两种检测方法诊断AML1/ETO阳性AML的真实性和可靠性评价

2.3.1 骨髓细胞形态学 详见表2。

表2 骨髓细胞形态学诊断AML1/ETO阳性的AML的真实性和可靠性评价

2.3.2 MFCM 详见表3。

由此可见,多参数流式细胞术诊断的灵敏度（81.82%vs25.00%)，符合率（88.64%vs62.50%)以及阴性预测值（84.00%vs57.14%)明显高于形态学，漏诊率(18.18%vs75.00%)明显低于形态学，特异度(95.50%vs100%)略低于形态学，综合诊断效能明显优于形态学。

表3 MFCM诊断AML1/ETO阳性的AML的真实性和可靠性评价

3 讨论

AML1/ETO 融合基因由染色体 t （8；21）（q22；q22）易位累及第21号染色体的急性粒细胞白血病基因1(AML1)和第8号染色体的ETO（Eight twe nty-one）基因[17]。本研究AML1/ETO阳性患者中,骨髓细胞形态学FAB分型为AML-M5占39%,AM L-M2及AML-M2a占34%，AML-M2b及提示AM L1/ETO阳性占25%,AML-M4占2%,与文献报道[18]的其在 M2中高达 54.7%,余依次为M1 17.6%和M4 8.8%的结果略有不同,可能与样本量或地域差异有关。

流式细胞术在急性白血病的诊断和分型中有重要价值[19,20],特异的免疫表型与疾病的预后以及细胞分子遗传学异常相关[21-26]。国内外已有相关文献报道过AML1/ETO阳性的AML的免疫表型特点。如Paietta等[27]的研究结果显示AML伴t(8;21)CD34表达的髓系原始细胞常常伴有CD19和CD56的表达，而CD33的表达减弱或缺失。国内也有学者报道AML伴t(8;21)明显高表达CD19和C D34,低表达 CD 33[26,28]。这与本研究的结果基本一致。但从抗原表达的阳性率来看，相关文献报道结果差异较大。Felicetto等[29]应用 CART和 Logistic回归统计方法,将CD 19配合 CD 34预测t(8;21)的正确率达到98.9%，而增加任何指标均不能提高诊断正确率,而最近又有文献报道，CD34的表达阳性率仅为70.76%,CD19的阳性率为73.3 1%。其结合cCD79a和CD56建立积分诊断系统后进行ROC曲线分析，曲线下面积为0.952，诊断效能明显提高[30]。其结果表明仅结合一种或两种抗原的表达仍有局限,结合多种抗原的表达能提高诊断效能。本结果显示44例AML1/ETO阳性的AML均表达 CD117、CD34、CD33 以及 HLA-DR，43 例表达 CD13（阳性率为 97.73%），42例（95.45%）患者表达CD19，且CD117和CD34为强表达，CD19为部分表达。CD19配合CD34预测AML1/ETO阳性的AML的阳性率为95.45%，这与Felicetto等的研究结果基本一致，但进一步分析发现在44例AML1/ETO阴性患者中有1例患者存在CD19、CD34与CD117的表达，1例患者存在CD19、CD34与HLA-DR的表达,故用CD19配合CD34再结合CD117、HLA-DR分析,结果显示诊断阳性率不变仍为95.45%,但在阴性患者中无1例存在CD117、CD34、HLA-DR以及CD19的共表达，提高了诊断的特异度和阳性预测值。

另外,骨髓细胞形态学和MFCM两种检测方法诊断AML1/ETO阳性的AML的真实性和可靠性评价的结果表明多参数流式细胞术的综合诊断效能高。分析原因可能是AML1/ETO阳性的AML细胞形态异质性较大,在一定程度上限制了骨髓细胞形态学的诊断。而此类病人的免疫表型特点尤为独特,不易造成漏诊或误诊。在分析8例确认AML 1/ETO融合基因阳性但流式细胞术没有提示存在融合基因患者的免疫表型特点,其中3例是由于编辑问题造成未能诊断，2例HLA-DR表达增强，2例无CD19表达，1例CD19表达增强造成未能诊断，见表1。

综上所述,多参数流式细胞术在AML1/ETO融合基因阳性AML的诊断中具有重要的应用价值，CD117、CD34、HLA-DR 以及 CD19 的共表达是AML1/ETO融合基因阳性AML独特的免疫表型，多参数流式细胞术为此类病人早期诊断、分型和预后分层提供重要依据。