微小RNA-221在宣威肺癌细胞中对靶基因p53正向凋亡调控因子调控机制的研究

张爱兴 ，马晓溪 ，陈冉 ，李庆 ，张慧 ，王玉明

（1.昆明医科大学第二附属医院检验科，云南 昆明 650101；2.昆明医科大学第一附属医院检验科，云南 昆明 650032）

肺癌是我国发病率及死亡率最高的癌症种类，有研究显示，该疾病的年死亡率为42.09/10万[1]。尤其是地处西南部的云南宣威地区。研究显示宣威肺癌患者中,男性和女性平均患病死亡率分别为 98.10/10 万，83.28/10 万[2]，居世界之首[3]。 p53 正向凋亡调控因子 （p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）是近年来发现的一种促凋亡因子,它是Bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员,在p53依赖与非依赖性细胞凋亡途径中均起重要作用，PUMA基因上游启动子序列中含p53的结合位点,受凋亡信号刺激后,p53可直接与其靶位点结合而促进PUMA的转录及蛋白表达[4,5]。前期研究显示,从肺癌组织中筛选出对PUMA可能具有调控作用的miRNA，其中有10条miRNA表达上调，miR-221升高较为明显[6]。迄今为止，关于miR-221调控肺癌细胞生长的系统性研究在国内外鲜见报道，由此，本研究根据miRNA的作用机制构建双荧光报告载体，以验证PUMA是否为miR-221的靶基因，进一步通过后续实验研究miR-221在宣威肺癌的发生、发展过程中可能具有的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 宣威肺癌细胞株（XWLC-05）购自中国科学院云南省肿瘤研究所；质粒pm irGLO购自美国Promega公司；质粒抽提试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Dual-Luciferase®Reporter Assay System、Caspase-Glo®3/7 Assay、Caspase-Glo®9 Assay购自美国 Promega公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；miR-221过表达/抑制表达载体购自美国GeneCopoeia公司；Taq DNA聚合酶 、Primescript RT Reagent kit、SYBR Premix Ex Taq kit购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 根据细胞贴壁生长的特性进行XWLC-05培养，使用的培养基为加入10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素双抗液的RPMI-1640细胞培养基，具体培养条件为37℃、5%CO2的培养箱。

1.2.2 PUMA载体的构建 从数据库中搜索PUMA基因中能够和miR-221相结合的序列片段，即其3’UTR端，然后设计并合成两段此3’UTR序列，一段作为野生型基因，即不改变其结合位点序列：5’AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGGCGCGGGGG ACTTTCTCTGCACCATGTAGCATACTGGACTCTAG TCTAGACTAG3’（正向序列）；而另一段作为突变型基因,即使其结合位点改变 （对照）：5’AGCTTT GTTTAAACGGCGCGCCGGCGCGGGGGACAAACA GACGAGGAAGAACGATACTGGACTCTAGTCTAG ACTAG3’（正向序列）,共同的下游系列为5’CTA GTCTAGACTAGAGTCCAGTATCGTTCTTCCTCGTC TGTTTGTCCCCCGCGCCGGCGCGCCGTTTAAACA AAGCT3’,在所有序列两端分别加入酶切位点及保护性碱基，退火酶切后，将两段基因片段分别与质粒连接,连接后导入大肠杆菌JM109进行转化并培养。挑选体积较大的菌落用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）方法和测序方法验证插入序列的正确性后，将菌落保存于-80℃备用。

1.2.3 双荧光素酶报告实验 培养的XWLC-05经表1中各组上述抽提野生型、突变型质粒载体分别进行转染,并于37℃、5%CO2培养箱继续培养4～6h后,改为在细胞培养液中继续培养48 h，然后使用Luciferase报告基因系统对其荧光素酶活性进行检测,每组做5个复孔，取其平均值进行计算。

表1 双荧光素酶报告实验分组

1.2.4 MTT比色法分析XWLC-05增殖 按表1野生型质粒转染组进行分组，在各组XWLC-05细胞中分别加入MTT液，并于37℃、5%CO2培养箱继续培养6 h后，立即加入DMSO，轻微地振荡混匀20 min。 XWLC-05 细胞经培养 0、24、48、72 h 后使用酶标仪于570 nm波长分别进行酶活性的检测，每组做5个复孔，取其平均值进行计算。

1.2.5 Caspase 3/7、Caspase 9的活性检测 首先将Caspase的反应底物及缓冲液充分混匀，混匀后静置于室温10 min，然后加入表1野生型质粒转染组各组XWLC-05细胞，于室温孵育30 min。使用酶标仪进行酶活性的检测，每组做5个复孔，取其平均值进行计算。

1.2.6 qRT-PCR检测各组XWLC-05中的PUMA的表达水平 使用TRIzol法提取表1野生型质粒转染组各组XWLC-05的总RNA,并使用Primescript RT Reagent kit将总RNA反转录为cDNA。以qRT-PCR方法检测各组PUMA的表达水平（上游引物为：ACACGGTAAAACCATGAC，下游引物为：GTCCAAACTCATCAATGTA， 内参：GAPDH）。qRT-PCR采用 SYBR Premix Ex Taq kit进行，反应条件为 95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；64 ℃、31 s；72 ℃、34 s，共进行40个循环，并检测其融解曲线，使用公式2-△Ct来计算其表达水平，△Ct=同一样本目的基因Ct值—内参基因Ct值。

1.3 统计学分析 使用SPSS 19.0统计软件包进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，并使用随机设计的单因素方差分析实验数据,采用Student-Newman-Keuls q检验比较多组间样本均数；两组均数比较采用t检验；如果数据为非正态分布以中位数（四分位数间距）［M（QR）］表示，使用 Kruskal-Wallis秩和检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 重组质粒的PCR及酶切鉴定 重组质粒经PCR扩增后，10%琼脂糖凝胶电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带；经PmeⅠ、XbaⅠ双酶切后,得到一条约7 300 bp的目的条带及空载体条带。见图1、图2。

图1 重组质粒PCR扩增产物凝胶电泳图

图2 重组质粒酶切图

2.2 重组质粒的测序结果 构建的表达载体经过测序分析后结果显示,所插入的PUMA3’UTR端序列（野生型、突变型）与设计相符，没有出现碱基突变和（或）缺失。质粒载体构建相关结果表明已成功构建质粒载体。见图3、图4。

图3 野生型重组载体PUMA测序结果

图4 突变型重组载体PUMA测序结果

2.3 荧光素酶报告实验证实PUMA基因是miR-221的靶基因 在实验组中，pGLO-PUMA(wt)+Over-miR-221转染组的荧光活性值为5.88±0.72，低于pGLO-PUMA(wt)转染组（11.52±1.24）（t=-8.662，P<0.001），荧光值大约降低了49%，见图5；另外如果转染报告基因质粒（wt）和inhibitor载体，则荧光素酶表达量会显著升高，pGLO-PUMA （wt）+In-mi R-221转染组荧光活性值为31.66±4.72，显著高于pGLO-PUMA（wt）转染组（10.12±1.58）（t=12.761，P<0.001），荧光值升高超过100%，见图6。

在对照组中,为了进一步确认miR-221的调节作用是通过其与靶基因相应序列互补配对,本研究下一步将质粒（wt）上的相应序列进行突变，构建突变质粒（mut）。当突变质粒和过表达载体同时转染时，荧光素酶表达量没有降低（t=0.806，P=0.445），见图5；同样地，突变也造成了inhibitor载体抑制效果的消除（t=1.755，P=0.117），见图 6。 上述结果表明重组质粒载体已经准确地插入到荧光素酶报告基因，并在XWLC-05细胞内进行了荧光素酶基因的表达，证实PUMA是miR-221的靶基因之一。

2.4 miR-221促进XWLC-05增殖 各组XWLC-05细胞分别培养 0、24、48 和 72 h 后，Control组和Scramble组按照肿瘤细胞增殖方式进行细胞增殖，过表达转染组培养24 h后,细胞的生长相比于Con trol组及Scramble组开始出现促进细胞增殖的现象，Over-miR-221组细胞的生长速度也明显高于Control组和Scramble组；抑制表达转染组中，细胞在培养24 h后开始出现明显的抑制现象,而且随着时间的延长，抑制程度也更加明显，In-miR-221组细胞的生长速度明显低于Control组和Scramble组[F(24 h)=98.181，P<0.001；F(48 h)=109.561，P<0.001；F(72 h)=143.782，P<0.001]，见图 7。

2.5 miR221通过Caspase抑制XWLC-05凋亡 相比Scramble组，In-miR-221组细胞的Caspase 3/7活性增高 （t=12.851，P<0.001）； 而 Over-miR-221组转染组中Caspase 3/7活性较低，与Scramble组相差不大（t=-2.181，P=0.061）。 而对于 Caspase 9，相比Scramble组，In-miR-221组细胞的Caspase 9活性也增高（t=15.491，P<0.001）；而 Over-miR-221组转染组中Caspase 9活性较低，与Scramble组相差不大（t=-2.056 ，P=0.074），见图 8、图 9。

2.6 XWLC-05过表达与抑制表达miR-221后PUMA基因的表达水平 因各组样本数据不符合正态分布，所以各组XWLC-05之间的PUMA表达水平通过Kruskal-Wallis秩和检验进行统计分析，差异无统计学意义（H=1.262，P=0.532），表明 miR-221在调控其靶基因PUMA表达的过程中，无论是过表达还是抑制表达,在靶基因PUMA的转录水平调控中无明显作用。

图5 过表达转染组荧光素酶活性检测miR-221与PUMA的相互作用

图6 抑制表达转染组荧光素酶活性检测miR-221与PUMA的相互作用

图7 各转染组细胞酶活性

图8 各转染组的Caspase 3/7活性

3 讨论

miR-221定位于X染色体p11.3区，呈成簇分布,是定性较为明确的原癌基因簇[7]。miR-221是一种很有潜力的生物靶向分子,在多种恶性肿瘤中均表达异常，例如Garofalo等[8]在研究与雌激素表达相关的miRNA时发现，miR-221直接作用于ERα基因的3’UTR端，它在MCF-7和T47D细胞中呈现异常表达，使ERα蛋白表达下降，而mRNA的表达并未降低。Lupini等[9]在分析通过过表达miR-221来影响甲状腺癌细胞生长的过程中，通过沉默机制对miR-221进行基因沉默,以此来影响并降低甲状腺癌细胞的细胞增殖能力,这表明miR-221可以在甲状腺癌细胞中起到促进细胞增殖的作用。此外，在胰腺癌、恶性胶质瘤等恶性肿瘤细胞中，miR-221的表达也都出现了异常[10,11]。

本研究结果显示,过表达转染组细胞生长相比Control组和Scramble组出现促进细胞增殖的作用；抑制表达转染组细胞在转染后24 h相比Control组和Scramble组出现了抑制细胞增殖的现象，且随着时间的推移，抑制程度也更加明显，这与Ie Sage以及Koelz等[12,13]的研究结果相符。

Caspase 3是引发细胞凋亡机制的一个关键酶,其主要功能是对pro Caspase 3、6、7和9进行剪切,并对许多Caspase底物进行直接特异性剪切，这些通过Caspase 3介导的蛋白剪切机制是细胞凋亡机制中的一个主要组成部分；Caspase 9则是细胞凋亡阶段中位于上游的一个Caspase，激活Caspase 9后可以进一步激活Caspase 3，进而促使后续细胞凋亡。在Caspase家族的凋亡信号通路中，已有研究证实puma可通过激活Caspase 3/Caspase 9等机制促进细胞凋亡以及抑制细胞增殖[14]。在本实验结果中，抑制表达转染组细胞Caspase 3/7和Caspase 9活性增高；而转染过表达组别中无论是Caspase 3/7还是Caspase 9，其活性均较低，与Control组及Scramble组相差不大。实验结果提示通过对miR-221进行抑制表达可以激活Caspase 3和Caspase 9凋亡机制,使Caspase活性增高并进一步促使肺癌细胞凋亡，这与Wu等[13]的研究结果一致；而在促进细胞增殖过程中，过表达miR-221可以促进细胞增殖，但Caspase活性变化不大，造成这种结果可能的原因是存在另外的机制促进细胞增殖，而并不是通过降低Caspase 3/7和Caspase 9活性来抑制细胞凋亡，进而促进细胞增殖。本研究在利用qRT-PCR方法检测PUMA表达水平的结果中，其统计学结果差异无统计学意义，这可能是因为PUMA只是miR-221的靶基因之一，还存在其他靶基因共同调控肺癌细胞增殖凋亡，miR-221可能通过抑制PUMA的翻译而非诱导PUMA的降解来调控基因表达。

本研究证实PUMA为miR-221的靶基因之一，这一结论与张春智等[15]在神经胶质瘤细胞中的结果相一致，转染Over-miR-221对宣威肺癌细胞的生长起到促进细胞增殖的作用,而在转染In-mi R-221时，细胞中Caspase 3/7、9的活性均升高，促进了细胞凋亡,最终抑制了肺癌细胞的生长。总之，miR-221可能通过负向调控PUMA以及其他靶基因来参与宣威肺癌的发生、发展，然而miR-221调控PUMA进一步影响宣威肺癌发生发展的机制仍待进一步研究。

图9 各转染组的Caspase 9活性