赣南地区亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T基因多态性分析

刘聪，张丽琴，徐静，刘婷，林燕

(赣州市人民医院检验科分子实验室，江西 赣州 341000)

我国人口基数大,新生儿出生缺陷频率也相对较高，这跟我国饮食习惯有直接关系。大量研究表明,叶酸摄入不足或不能被人体有效利用是导致出生缺陷的主要原因[1]。2017年《围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南》中指出，孕前3个月到孕后12周每天服用叶酸量不低于400mg来降低新生儿出生缺陷率。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因位于1P36.3,有多种基因多态性,最常见的是C6 77T，是叶酸及HCY（同型半胱氨酸）代谢的关键酶,将5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-亚甲基四氢叶酸。5-亚甲基四氢叶酸作为血清及组织中叶酸主要存在形式,参与体内DNA、RNA和蛋白质等的甲基化修饰及多种重要的生化反应。当MTHFR 677位点碱基发生突变（C>T）时,MTHFR酶活性降低，导致5-亚甲基四氢叶酸减少，影响蛋白质等大分子甲基化程度，导致胚胎发育异常[2]。有关研究表明由该基因突变导致新生儿出生缺陷概率约为13.4‰[3],并有逐年上升趋势。杂合CT基因型MTH FR酶活性为60%左右,而纯合TT基因型MTHFR酶活性为30%左右，酶活性减低导致叶酸利用障碍，引起复发流产、神经管畸形、妊娠期高血压等疾病[4]。在中国人群中MTHFR基因异常发生率高达17%~47%[1]。本文通过检测赣南地区MTHFR（C677T)基因突变分布情况，以此了解该地区该基因多态性分布。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2017年5月-2018年3月间，来赣州市人民医院就诊患者为研究对象,共1787例，平均年龄为（28.36±4.23）岁。入组原则：⑴近期未做过手术，无肝肾、血液等系统疾病，无精神障碍等疾病，各自间无亲缘关系；⑵本研究由赣州市人民医院医学伦理委员会批准,患者本人签署知情者同意书。

1.2 仪器和试剂 MTHFR基因检测试剂盒由深圳奥萨医疗有限公司生产,基因扩增仪为罗氏Z480荧光定量PCR仪。

1.3 实验方法 采用PCR-荧光探针法,采集患者EDTA抗凝全血2ml，按试剂盒操作步骤进行DNA提取,按以下步骤进行 PCR，50℃ 2min；95℃ 2min；95℃ 15s；60℃ 1min，45个循环。 荧光信号收集定在FAM和VIC，60℃时收集数据。

1.4 统计学分析 对受检孕妇进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验,对数据采用SPSS13.0软件进行分析,赣南地区十八个县该基因突变频率进行比较，总数据分别与山东、河南两省进行比较，组间比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 采用荧光定量PCR法对MTHFR（C677T）基因型及Hardy-Weinberg遗传平衡检验 阴性对照一般无扩增曲线或有微量起峰，CC型为单个VIC通道成S型扩增曲线；CT型为VIC和FAM两个通道成S型扩增曲线；正常的信号分为4堆，靠近原点处为NTC；靠近 X轴的是VIC信号(CC基因型)；靠近Y轴的是FAM信号(TT基因型)；靠近对角线位置的样品既有 FAM信号也有 VIC信号 （CT基因型）,强度为 FAM和 VIC各自的一半左右,如图1所示。Hardy-Weinberg遗传平衡检测验：P=0.827,P>0.05，说明此标本具有群体代表性。

图1 散点图

2.2 MTHFR（C677T）基因型与补充叶酸计量的关系 不同基因型补充叶酸计量有差异，如图2所示。

2.3 赣南地区不同县MTHFR（C677T）基因分布情况 将赣南地区十八个县数据进行比较无差异性，无统计学意义 （P>0.05）χ2=16.629 P=0.549>0.05，见表1。

图2 不同MTHFR（C677T）基因型补充叶酸量

表1 赣南地区十八个县MTHFRC677T基因型比较

2.4 赣南地区与山东、河南等地区MTHFR（C677T）基因型比较 本文将赣南地区数据分别与山东[5]、河南[5]等省份数据进行比较有差异性，具有统计学意义（P=0.000<0.01），见表 2。

表2 赣南地区与山东、湖北、新疆等省MTHFR（C677T）基因型比较

3 讨论

叶酸是一种水溶性B组维生素,最初是从菠菜中提取得到。对热不稳定，易在烹饪过程中破坏，而我国的饮食习惯主要以烹饪为主。因此尽管食物中含有丰富叶酸，实际能被人体吸收、利用的却很有限。对于某些特殊人群，如高同型半胱氨酸患者、孕期妇女等,他们对叶酸需求量要比正常人多，甚至要翻倍补充，但由于遗传因素原因，相当一部分人由于MTHFR（C677T）基因位点突变导致叶酸利用转化能力下降,因此这部分人群极易出现叶酸缺乏。叶酸又是是合成核酸所必需的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质,更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸的缺乏会导致胎儿发育异常，如Down综合症、唇腭裂、自然流产等[6-7]，也会增加脑卒中风险。

人类MTHFR基因是叶酸代谢的关键酶，具有多种基因型，其中最常见的是第677位碱基C被T置换，产生Ala222Val错义突变，合成的蛋白质会出现酶活性改变，纯合突变基因型（TT）编码蛋白的酶活性相当于纯合野生基因型（CC）的30%，杂合基因型（CT）编码蛋白的酶活性相当于纯合野生基因型编码酶活性的65%。该酶活性的降低会引发叶酸利用障碍，在孕早期会干扰神经管闭合，导致先天性心脏病[8]、神经管缺陷[9]等多种出生缺陷疾病；同时会引起高同型半胱氨酸血症，损伤内皮细胞和血管平滑肌细胞，诱导内皮细胞激活促凝因子，使机体处于高凝状态，从而引发血栓，增加脑血管疾病[10]风险。有研究表明，MTHFRC 677T基因多态性与前列腺癌[11]、口腔癌[12]、甲状腺癌[13]、2型糖尿病肾病发生发展[16]等有关。

MTHFR基因多态性存在地域差异性[14]，本研究表明赣南地区与山东、河南等省份比较有差异性，但赣南地区内十八个县相比较无差异性。本研究通过分析来我院就诊的1495例患者MTHFR（C677T）基因型，将此数据与已报道省份比较，发现MTHFRC677T的等位基因分布频率与地域有关,突变基因型T的频率在我国从南往北逐渐升高[15]，这与我国报道的出生缺陷北高南低的事实相符[16,17]。 因此，通过 MTHFR（C677T）大样本分子流行病学调查，了解其与叶酸利用代谢的关系，分析其基因频率分布特点，可以为指导地区人群补充叶酸提供基础理论依据。