牛蒡多酚超声辅助酶法提取工艺及抗氧化活性

马艳弘 ，孟 勇 ，崔 晋 ，张宏志 ，曹培杰 ，孟 超

（1. 江苏省农业科学院 农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2. 徐州世缘食品有限公司，江苏 徐州 221723）

牛蒡（Arctium lappa L.）又名大力子、蒡翁菜、牛菜等，是公认的食药同源性蔬菜。 年蒡含蛋白质、多种氨基酸、微量元素、维生素等，还含有菊糖、绿原酸、牛蒡苷、膳食纤维、多酚等生物活性成分[1-3]，具有清除氧自由基，提高人体免疫力等多种保健功效[4-6]，其营养和经济价值高，开发应用前景广阔。

目前国内外对牛蒡的研究主要集中在牛蒡苷、木脂素、菊糖等物质的检测、分析，分离和纯化及其功能鉴定等方面[7-9]。 多酚是牛蒡生物保健功能的主要物质基础之一[10-12]，其提取方法包括溶剂提取、酶法辅助提取、微波辅助提取、超声提取等方法。 采用超声辅助酶法提取活性物质的提取时间短、提取效率高、而且产物易纯化，已广泛应用于花色苷、蛋白质、多糖等物质的高效制备[13-15]，但有关牛蒡多酚超声辅助酶法提取的研究鲜见报道。 作者采用超声辅助纤维素酶法提取牛蒡多酚，优化其提取工艺并探讨提取物的抗氧化活性，为拓宽牛蒡加工途径、延长产业链、实现牛蒡多酚的产业化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛蒡：徐州世缘食品有限公司提供。 牛蒡清洗干净后置于恒温干燥箱60℃干燥至恒重，粉碎过筛，低温保藏备用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：上海源叶生物科技公司产品；羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测定试剂盒：南京建成生物工程研究所产品；苯酚、无水乙醇、柠檬酸、盐酸、氯化钾等试剂为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

KQ-2500E 超声波机：昆山禾创仪器公司产品；真空冷冻干燥机：美国Thermo 公司产品； RE5220型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂产品；D-8 紫外分光光度计：南京菲勒仪器有限公司产品；MJ-BL15U11破壁搅拌机：广东美的电器制造有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡多酚提取工艺 牛蒡粉称重，加入乙醇溶液，置于450 W 功率下进行超声处理，然后按比例加入纤维素酶，恒温提取一段时间，4 500 r/min离心 15～20 min，分离上清，将沉淀再提取 1 次，2 次提取所得上清即为多酚提取液。 浓缩提取液，通过大孔树脂AB-8 进行纯化，经乙醇溶液洗脱、浓缩，冷干，即得牛蒡多酚。

1.3.2 总酚的测定 福林酚比色法测定多酚质量分数[16]，以没食子酸为标品制标曲，分别加入5 mL蒸馏水，1 mL FC 试剂和3 mL 质量分数7.5% Na2CO3溶液，45 ℃水浴加热 90 min 后，在波长 760 nm 处测吸光度，得到没食子酸质量浓度与吸光度的回归方程：y=0.005 3x - 0.015 2（R2=0.998 9），据此标曲计算牛蒡多酚质量分数（按没食子酸计），再按照公式（1）计算其多酚得率Y。

式中：Y 为多酚得率，（mg/g）；C 为多酚质量浓度，（mg/mL）；V 为提取液的总体积，（mL）；m 为牛蒡粉质量，（g）。

1.3.3 单因素试验设计 分别考察不同乙醇体积分数（30 %、40 %、50 %、60 %、70 %）、不同液料体积质量比（5、10、15、20、25 mL/g）、不同超声波时间（3、6、9、12、15 min）、不同纤维素酶质量浓度（0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL）、不同酶解温度（45、50、55、60、65 ℃）、不同酶解时间（30、45、60、75、90 min）等 6 个因素对多酚提取率的影响，根据结果确定适宜的提取条件。

1.3.4 Box-Behnken 试验设计及响应面分析 采用Box-Behnken 设计方案，在单因素试验的基础上，以乙醇质量分数 （A）、 纤维素酶质量浓度/（mg/mL）（B）、酶解时间/min（C）、酶解温度/℃（D）为考察因素，以牛蒡多酚得率为响应值，利用Design-Expert 8.05 软件优化工艺参数。 因素水平见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计因素和水平编码表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5 牛蒡多酚抗氧化活性分析[17-18]

1）牛蒡多酚对DPPH 自由基清除能力测定 配置0.05 mg/mL 的DPPH 自由基溶液，取不同体积的多酚溶液，加去氧水补足1 mL，分别加入5 mL DPPH溶液，混合均匀后避光反应30 min，用分光光度计分别测定517 nm 处的吸光度值A1，5 mL DPPH溶液与1 mL 无水乙醇混合后测得的吸光度值A0，5 mL无水乙醇与1 mL 多酚溶液混合后测得的吸光度值A2。 按照公式（2）计算 DPPH 自由基清除率。

式中：A1为样品管吸光度值；A2为对照管吸光度值；A0为空白管吸光度值。

2）牛蒡多酚抗超氧阴离子自由基能力测定 按照试剂盒说明书，分别取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多酚溶液及同质量浓度VC 溶液，测定550 nm 处的吸光度值。 对照组用无水乙醇代替样品，按照式（3）计算抗超氧阴离子自由基活力单位。

式（3）中：A1为样品管吸光度值；A2为对照管吸光度值；A0为标准管吸光度值。

3）牛蒡多酚清除羟自由基能力测定 按照试剂盒说明书操作，分别取500 μL 不同质量浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）的多酚溶液和 VC 溶液，测定550 nm 处的吸光值。 按照式（4）计算羟自由基清除率。

式中：A1为试验管吸光度值；A0为对照管吸光度值。

2 结果与分析

2.1 牛蒡多酚提取单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对牛蒡多酚提取量的影响 由图1 可知，乙醇体积分数在30%～50%之间，随着乙醇体积分数的提高，多酚提取率逐渐提高，在乙醇体积分数达到50%时，多酚的提取率达到最大值23.78 mg/g；乙醇体积分数在50%～60%之间，多酚得率变化平缓；乙醇体积分数大于60%，多酚得率随着质量分数提高反而下降。 这是由于高体积分数提取溶剂会引起细胞蛋白质变性，间接影响多酚溶出，最终导致了得率的降低[19]。因此选择乙醇的适宜体积分数为50%。

图1 乙醇体积分数对多酚得率的影响Fig. 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.2 液料体积质量比对牛蒡多酚提取量的影响由图2 可知，多酚得率会随液料体积质量比的增加而逐渐增大，在20 mL/g 时，提取率达到峰值25.52 mg/g，之后再增大液料体积质量比，多酚得率变化平缓，表明20 mL/g 的液料体积质量比即可使多酚溶出达到平衡，由此将20 mL/g 确定为牛蒡多酚的最佳液料体积质量比。

图2 液料体积质量比对多酚得率的影响Fig. 2 Effect of solid to liquid radio on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.3 超声时间对牛蒡多酚提取量的影响

图3 可见，3～6 min 范围内多酚得率随着超声时间延长而提高，到6 min 时，提取率达到最大（29.68 mg/g），这是由于 6 min 内，超声的空化效应随时间的延长而增强，细胞破坏程度增大，从而导致多酚溶出、得率提高；超过6 min 后多酚得率开始下降，是由于长时间的超声波作用引起了多酚的共价键断裂进而引发了多酚的降解，因此，确定适宜的超声时间为6 min。

图3 超声时间对多酚得率的影响Fig. 3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.4 纤维素酶量对牛蒡多酚提取量的影响 由图 4 可见，在 0.5～1.0 mg/mL 添加范围内，随着纤维素酶用量的加大，多酚得率也明显提高，当酶用量为1.0 mg/mL 时，多酚得率达到最大值39.03 mg/g。之后继续提高酶的用量，多酚得率反而降低。 表明适量纤维素酶的添加有利于破坏牛蒡的细胞壁结构，增强多酚的溶出效率，但是酶用量过多，会导致溶剂粘度增高、阻塞细胞内含物的溶出通道，从而导致其提取率的下降。

图4 纤维素酶质量浓度对多酚得率的影响Fig. 4 Effect of cellulase concentration on extraction rate of polyphenols from burdock

2.1.5 酶解温度对牛蒡多酚得率的影响 由图5可知，酶解温度在45～50 ℃之间，多酚得率随酶解温度的升高而升高，在酶解温度达到50 ℃时达到峰值38.05 mg/g； 而多酚得率在55～60 ℃之间则基本趋于稳定；超过60℃后，多酚得率反而下降。 表明温度过高会使酶蛋白变性，酶活性降低，从而导致多酚提取率降低。 由此确定牛蒡多酚的适宜酶解温度为50℃。

图5 酶解温度对多酚得率的影响Fig. 5 Effect of cellulase reaction temperature on polyphenols yield from burdock

2.1.6 酶解时间对牛蒡多酚提取量的影响 从图6可以看出，酶解时间在30～75 min 之间，酶解时间越长，多酚得率越高，在75 min 时多酚得率达到最大（39.71 mg/g），大于75 min 后多酚提取率反而下降。这是由于适宜的反应时间能够促使底物和酶接触充分，进而提高了牛酚得率。 由此可确定75 min 为牛蒡多酚的最佳酶解时间。

图6 酶解时间对多酚得率的影响Fig. 6 Effect of cellulase reaction time on polyphenols yield from burdock

2.2 牛蒡多酚提取条件响应面优化结果

2.2.1 回归模型建立与显著性检验 根据Boxbehnken 的中心组合设计原则，以多酚得率为响应值，优化牛蒡多酚的提取工艺。 结果见表2。 利用Design Expert8.05 软件对表中数据进行分析，得到响应值对几个自变量的回归方程为：

Y=41.21-0.21A+1.75B-0.40C+0.29D-0.53AB-1.13AC+1.13AD+0.99BC+0.50BD+1.28CD-0.55A2-2.571B2-1.46C2-1.00D2

表2 Box-Behnken 实验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

由方差分析结果表3 可知，该回归模型高度显著（P＜0.000 1），失拟项（P=0.092 8）不显著，表明试验值与预测值高度相关模型与实验拟合良好，该模型可以反应牛蒡多酚得率的预测与分析[20]。表3 还反应了4 个自变量对响应值多酚得率的影响程度，其影响大小排序依次为纤维素酶质量浓度（B）＞酶解时间（C）＞酶解温度（D）＞乙醇体积分数（A），其中因素C 对多酚得率影响显著（P＜0.05），因素 B 和 AC、AD、BC、CD 的交互作用对多酚得率的影响极显著（P＜0.01）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

2.2.2 牛蒡多酚提取量响应面分析与优化 图7反映了两两因素间的交互作用对牛蒡多酚提取量的影响情况。 曲面越陡，表明变量对多酚得率影响越大[21]。 由图可见，除乙醇体积分数与酶质量浓度（AB）、酶质量浓度与酶解温度（BD）的交互作用对提取量的影响不显著（P＞0.05）外，乙醇体积分数与酶解时间（AC）、乙醇体积分数与酶解温度（AD）、酶质量浓度与酶解时间（BC）、酶解温度与时间（CD）的互作效应对牛蒡多酚得率的影响极显著 （P＜0.01）。经软件分析，得到的最佳提取参数为：乙醇体积分数43.68%、纤维素酶质量浓度1.24 mg/mL、酶解时间79.81 min、酶解温度50.56 ℃，此条件下牛蒡多酚得率为41.65 mg/g。经综合考虑，修正为：乙醇体积分数45%、纤维素酶质量浓度1.25 mg/mL、酶解时间80 min、酶解温度50 ℃。 经验证，此条件下多酚提取率为41.33 mg/g，实测值与预测值相对偏差在0.76%左右，证明该模型可用于预测牛蒡多酚提取状况。

2.2.3 超声波辅助纤维素酶法与其他提取方法的比较 比较超声辅助酶法提取方法、 超声提取、酶法提取方法对牛蒡多酚提取量的影响，结果发现3种方法的多酚得率分别为 41.33、29.67、33.03 mg/g，超声辅助酶法提取的多酚得率比其他2 种方法分别提高了39.30 %、25.13 %。 这是由于一方面纤维素酶可破坏牛蒡细胞壁结构，促使多酚外溢；另一方面，超声波的空化效应和振动作用，也能促使牛蒡细胞破裂，导致多酚从细胞中溶出；同时，短时间的超声处理还能够促进酶分子空间构象发生变化、加速底物与酶的接触，从而增强纤维素酶活力、提高酶解效率[22-24]。

图7 各因素交互作用影响牛蒡多酚提取量的响应面图Fig. 7 Response surface plot showing the effects of ethanol concentration, cellulase concentration,cellulase reaction temperature, and time on the yield of polyphenols from burdock

2.3 牛蒡多酚抗氧化活性分析

2.3.1 牛蒡多酚对DPPH 自由基的清除作用 如图8 所示，牛蒡多酚的DPPH 自由基清除率随其质量浓度的提高而逐渐增强，当质量浓度为0.5 mg/mL时，对DPPH 自由基的清除率达最大（55.66%），与同质量浓度VC 溶液对 DPPH 自由基的清除率（55.81%）相比并无差异，表明牛蒡多酚具有很强的DPPH 自由基清除能力。

图8 牛蒡多酚的DPPH 自由基清除能力Fig. 8 DPPH radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

2.3.2 牛蒡多酚的抗超氧阴离子活力 如图9 所示，牛蒡多酚的抗超氧阴离子自由基能力随着多酚质量浓度增大而增强，但是略低于同质量浓度VC的抗超氧阴离子活力。

图9 牛蒡多酚的抗超氧阴离子自由基能力Fig. 9 Superoxide anion radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

图10 牛蒡多酚的羟自由基清除能力Fig. 10 Hydroxyl radical scavenging capacity of polyphenols from burdock

2.3.3 牛蒡多酚对羟自由基的清除作用 由图10可示，牛蒡多酚对羟自由基的清除率随着多酚质量浓度提高而增强，具有明显的量效关系。 但牛蒡多酚对羟自由基的清除效果明显低于同质量浓度的VC。

3 结 语

以多酚提取率为指标，在单因素试验基础上通过响应面分析法优化了牛蒡多酚超声辅助酶法提取工艺，建立的牛蒡多酚预测模型为Y= 41.21-0.21A+ 1.75B- 0.40C+ 0.29D- 0.53AB- 1.13AC+1.13AD + 0.99BC + 0.50BD + 1.28CD - 0.55A2-2.571B2- 1.46C2-1.00D2，最优提取条件为：乙醇体积分数45%、液料体积质量比20 mL/g、450 W 超声功率下超声处理6 min，纤维素酶质量浓度1.25 mg/mL、酶解时间80 min、酶解温度50 ℃。 此条件下牛蒡多酚的提取量最大，达41.33 mg/g，比超声波辅助法和纤维素酶法分别的多酚得率分别提高了39.30%、25.13%。

通过检测牛蒡多酚的DPPH 自由基清除能力、抗超氧阴离子自由基能力、 羟自由基清除能力发现，所提牛蒡多酚具有较强的抗氧化活性，其对DPPH 自由基的清除作用最强，对羟基自由基的清除作用较弱。