温度对支链淀粉脱支重结晶特性的影响

王志伟，郭媚下，周中凯

（天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457）

近年来，可生物降解纳米晶和纳米粒子的制备和应用引起了人们越来越多的研究兴趣。 淀粉作为一种典型的绿色可生物降解天然高分子，是制备纳米晶和纳米粒子的理想选择。 目前制备方法主要有酸水解和酶解法，但是酸水解对环境有一定负面影响。Majian 等人[1]醇沉煮沸的土豆淀粉，得到50～100 nm的纳米淀粉颗粒；Kim 等人[2]通过正丁醇和酶水解的结合的方法，得到的是10～20 nm 的粒子；但是现在越来越多学者为了避免使用化学试剂，采用普鲁兰酶酶解的方法。 普鲁兰酶又称支链淀粉6-葡聚糖水解酶，可以裂解α-葡聚糖多糖，是一种广泛存在的酶。 Shi等人[3]将糯玉米淀粉经酶解后，在室温下干燥，在45 ℃下干燥12 h，制得抗性淀粉，但粒径约为0.8～2.0μm。研究发现，分枝短线性葡聚糖在低温下通过冷冻干燥容易形成纳米淀粉颗粒[3]。 目前通过酶解和再结晶制备纳米淀粉颗粒的研究日渐深入，但重结晶自组装机制的研究还较少。

作者以支链质量分数99%的淀粉为原料，经过糊化断开其结晶区的氢键，打开分子中双螺旋结构，分子结构从有序状态变得无序。 普鲁兰酶对支链淀粉的α-1，6 糖苷键专一水解从而进行脱支，产生更多较为均一的短直葡聚糖链，从而易于老化重结晶。 采用分离重结晶淀粉水溶液的上清和沉淀，以SEM、FTIR 和 XRD 等技术手段研究不同温度不同部分所获得的淀粉结晶体的形态和物化性质，进行多方面表征和综合分析，进一步了解支链淀粉脱支后在水溶液自组装过程。

1 材料与方法

1.1 原料

支链淀粉（来自蜡质玉米）：美国C&M Biolabs公司产品；普鲁兰酶（1000 ASPU/mL）：丹麦Danisco公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

水浴恒温振荡器、数显恒温水浴锅：天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；立式蒸汽灭菌器：上海华线区用核子仪器有限公司产品； 台式离心机：北京白洋医疗器械有限公司产品；糖量计：上海米青科实业有限公司产品；冷冻干燥仪：赛默飞事尔科技有限公司产品；BT-9300H 激光粒径分布仪：丹东百特仪器有限公司产品；X 射线衍射仪（XRD）：日本岛津公司产品；丹东通达仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪 （FTIR）：德国布鲁克光谱仪公司产品；SU-1510 扫描式电子显微镜：日本日立公司产品；Q-50 热重分析仪：沃特斯中国有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 样品制备在Sun[4]等基础上改进。称取2.5 g 支链淀粉，加入25 g 蒸馏水，先将淀粉沸水煮沸30 min 再经过高温高压锅处理30～40 min使其完全糊化，将糊化液放置水浴锅恒温至58 ℃，加入普鲁兰酶80 μL（参照文献[5]，同样实验条件下此添加量时脱支效果佳），在58 ℃恒温水浴摇床完成12 h 脱支过程。脱支完成后再将反应液之于高压蒸汽灭菌锅中灭酶30～40 min，分别置于4、25（常温）、30、40 ℃的恒温培养箱中重结晶48 h。结晶完成后，离心分离，首先小心用吸管取得上清置于冻干平皿中，避免掺入沉淀；沉淀再用蒸馏水清洗3～4 次，同样移入冻干平皿中。 预冻12～24 h 后经冷冻干燥得到重结晶后上清和沉淀的冻干粉末样品备用。

1.3.2 高效液相色谱分析重结晶前后清液分子分布 分别取脱支完成后和重结晶完成后的清液用于HPLC 测定[6]重结晶前后清液淀粉分子分布。 色谱柱为TSK-GEL-SW 凝胶柱，检测器为示差折光检测器。

1.3.3 重结晶上清液可溶性糖参于重结晶絮凝速率 在脱支淀粉溶液于 4、25（常温）、30、40 ℃的恒温培养箱中重结晶的过程中，每隔12 h 取样品液1 mL，10 000 r/min 离心10 min，用糖量计测量上清中可溶性糖的含量，每个时间点点测3 次求平均值，共测量5 个时间点。

1.3.4 重结晶沉淀的粒径分布 取适量沉淀冻干物溶于蒸馏水中，超声波震荡30 min 后用于粒度分布测试。 添加溶液于激光粒径分布仪中，缓慢滴加调整质量分数为12%后开始测定，经计算机软件处理得到粒径分布数据。

1.3.5 重结晶上清和沉淀的形态观察 采用扫描电子显微镜进行样品形态观察。 用棉签轻轻蘸取各个样品均匀且薄薄地涂抹在圆形托盘上的导电胶表面上，喷进镀膜，置于电子显微镜下观察。 采取不同放大倍数进行观察拍照。

1.3.6 FTIR 分析重结晶上清和沉淀物理结构 取样品1 mg 加入适量溴化钾充分研磨、压片。 光谱范围 4 000～400 cm-1，分辨率为 4 cm-1，扫描次数：16。用OMNIC 软件对所得图谱进行傅里叶去卷积处理分析。

1.3.7 X 射线射XRD 分析重结晶上清和沉淀的结晶结构 取适量样品置于扫描圆盘凹槽中，铺平压实待测。 测定条件：衍射角（2 θ）范围，扫描范围为5～35°，扫描速度为 1.2°/min，检测步宽 0.02°，管压30 KV，管流20 mA。 所得数据用Jade6.0 进行分析处理。 参照文献中[2]方法计算结晶度。

1.3.8 重结晶上清和沉淀的热分析 称取不同样品均3 mg 左右装入热重天平篮中，通入90 mL/min流量的高纯氮气吹扫，从常温开始，以10 ℃/min 的升温速度升至600 ℃，得到微分热重曲线。

2 结果与分析

2.1 温度对重结晶沉淀得率的影响

结晶体沉淀的得率是衡量淀粉分子重结晶难易程度的主要指标之一。 温度是影响淀粉自组装过程的重要因素，因为淀粉分子重排过程涉及了晶核生成、晶核增长和完美晶体结构3 个过程，温度影响淀粉分子的运动，进而影响到淀粉分子晶核的形成，以及晶核的增长速度和增长过程中分子的重排方式。 图1 中可明显看到随着结晶温度的升高越难絮凝，且得率也越低，40 ℃下只有不到10% 的得率，这可能由于在较高温度下淀粉分子运动较为剧烈，分子重排需要更高的能量来完成，最终降低淀粉的结晶率，甚至当升高到一定温度几乎不会絮凝产生重结晶体。

图1 不同温度重结晶沉淀得率Fig. 1 Recrystallization precipitation yield at different temperature

2.2 温度对重结晶上清液可溶性糖质量分数变化

支链淀粉经过酶解脱支后，因可溶性糖溶于水因此使用糖度计可测出上清液中可溶性糖的质量分数。 图2 中看到，不同温度下重结晶的淀粉溶液上清中的可溶性糖质量分数会随着重结晶的进行而发生不同趋势的降低变化，说明支链淀粉脱支后溶液有可溶性糖且会逐步参与到重结晶沉淀的絮凝中，变化快慢也与可溶性糖参于重结晶沉淀结晶的速率一致。4 ℃环境下，前12 小时降低幅度很大，随温度升高，降低趋势减缓。 这里的讨论不包括不可溶性糖参于结晶的情况，以后还需继续全面深刻地研究。

图2 不同温度重结晶上清液可溶性糖质量分数变化Fig. 2 Changes of soluble sugar content in supernatant of recrystallization from different temperature

2.3 温度对重结晶沉淀粒径分布的影响

d50 为颗粒中位径，数值越大表示颗粒群颗粒大；（d90-d10）/d50 用来表征大小颗粒差异程度，即离散程度离散程度越小，粒度分布范围越窄，粒径越集中，颗粒均一性越好[7]。 原淀粉粒径 13.5 μm 左右，离散程度1.47，原淀粉颗粒均一性较好。 脱支后，粒径均减小，但是均一性变差。 低温4 ℃下重结晶得到的沉淀粒径最小，离散程度最小，颗粒均一性最好。

2.4 温度对重结晶沉淀和上清液形态的影响

图3 可见，上清液颗粒较沉淀颗粒大。 低温4 ℃下，上清液为表面光滑片状和少量圆棒状，温度升高仍为片状但是放大倍数下显示为大小均匀的圆形颗粒联结状，在30 ℃下颗粒较大；不同温度下得到的沉淀颗粒则均为为微小米粒状，大小差异不大，随温度升高到40 ℃，颗粒接近微球状。

图3 不同温度上清液的电镜对比图Fig. 3 Comparison of different temperature and electronmicroscope supernatant and precipitation

2.5 XRD 衍射图谱分析

2.5.1 温度对重结晶沉淀结晶度及晶型的影响 原支链淀粉（native strach，NS）衍射峰 15°、17°、 18°、23°，表现出典型的 A 型结构。 如图 4 所示，不同温度重结晶淀粉沉淀X-射线衍射峰减少，4 ℃、常温、30 ℃均为B 型，温度到40 ℃则为B+V，相对结晶度达到69 %。那么确认脱支重结晶淀粉沉淀物含有部分有序的晶体结构，而且较原淀粉结晶度随温度的升高而增大。 分子间的作用力被更多的氢键强化，因此需要更多的能量来破坏结构[8]。

图4 不同温度重结晶淀粉沉淀衍射图谱Fig. 4 Diffraction pattern of recrystallization starch precipitation at different temperature

2.5.2 温度对重结晶上清液结晶度及晶型的影响 图5 显示，温度对上清物影响较大，低温下淀粉溶液絮凝速度快，上清物质图谱为馒头峰，成为非晶物质。而结晶温度升高，不易絮凝，有着几乎类似的X-射线衍射图案，在17°和22°有衍射峰，表明上清液淀粉分子也存在重结晶行为，显示为B 型结晶。

图5 不同温度重结晶淀粉上清液衍射图谱Fig. 5 Diffraction pattern of recrystallization starch supernatant at different temperature

重结晶是个复杂的过程，包括构象的变化，链排列、晶体堆积、相位传播[9]。 另一方面，脱支释放短线性聚合物，有利于晶体重结晶，较长的直链淀粉链更快形成网络，阻碍晶粒有序生长。 随着淀粉浓度的增加，短链直链淀粉往往形成更好的双螺旋结构存在，但随着温度的降低，直链淀粉分子链的运动剧烈程度增加受到抑制，这可能导致了淀粉沉淀的相对结晶度降低。 上清液也表现出这样的趋势，而且相对于原淀粉和重结晶沉淀结晶度明显降低了，可能与上清液是较长的直链淀粉形成网络，内部结构不够有序有关。

2.6 红外分析

将不同温度的上清和沉淀冻干样进行红外测定，利用OMNIC 软件对红处的外图谱进行傅里叶去卷积处理，可以有效分析淀粉分子链构象和双螺旋结构的改变。 在红外图谱中1 047 cm-1处的吸收峰是结晶区的特征吸收峰，代表了分子内的有序结构； 在1 022 cm-1处的吸收峰是非结晶区的特征吸收峰；996～1 000 cm-1处的吸收峰是 C-OH 的弯曲震动。 1 047cm-1/1 022cm-1，1 022cm-1/998cm-1被称作淀粉结构因子指数[10]，这是综合考虑3 个特征峰得到的。 图中用c 表示，是描述淀粉结晶结构的综合指标。从图中可以看出，重结晶沉淀a 值和c 值均随着温度升高呈现增大趋势，这说明随着温度变大，重结晶体沉淀相对结晶程度升高，分子排列的有序性升高，即温度越低，絮凝越快速，分子重排所用时间越短，短时间的快速重排就导致了分子链之间双螺旋结构和相互交联的无序性，反之，温度温度越高，高分子链之间形成双螺旋的交联所需时间越长，这样由短链的直链淀粉重新组装成的重结晶沉淀显得有序和完美；而不同温度分别对应的上清液 a、c 值在 30 ℃以下，呈现相同趋势，40 ℃发生下降，同样可以看到上清中也形成了与沉淀空间结构不同的重结晶，因此悬浮在上清液中，较高温度（40℃）下，可能由于温度高，空间结构松散，分子活动性高，导致上清的有序性降低。

图6 上清液和沉淀的相关红外指标Fig. 6 FTIR indicators of supernatant and precipitation

2.7 热稳定性分析

如图7、8 分别为重结晶不同温度沉淀和上清液的TGA、DTG 曲线。 图7 中可以看到有2 个质量损失。 第1 个在50 ℃到110 ℃，在样品的起始温度下降之前，与水的蒸发有关。 第2 个在170 ℃到310℃，这个分解过程主要与颗粒大小和分子间作用力影响有关[11]。 图8 显示的是不同条件下最大降解速率的温度，较高的温度通常代表更大的稳定性[12]。原淀粉分解温度在344 ℃，经过脱支和重结晶，最大降解速率的温度降低。 上清液降低幅度大于沉淀，表明重结晶后热稳定性降低。 所有重结晶样品在一个更宽范围内进行。 天然样品的降解温度较高，但温度范围窄。 一个可能的解释是，天然淀粉颗粒表面致密，紧凑的内部结构由直链淀粉和淀粉果胶，因此需要更多的热量来完成相变。 沉淀的最大速率降解温度随着结晶温度的升高呈下降趋势，而上清则是随着结晶温度升高而升高。 这与2.1 中叙述温度越高重结晶淀粉愈难于絮凝是有很大关系的，温度愈高，沉淀难以絮凝，所含淀粉物质少，稳定性越差；上清则所含淀粉多，稳定性就相对越强。

图7 不同温度重结晶淀粉沉淀和上清的TGA 曲线Fig. 7 TGA curves of starch precipitation and supernatant after recrystallization at different temperature

图8 不同温度重结晶淀粉沉淀和上清液的DTG 曲线Fig. 8 DTG curves of starch precipitation and supernatant after recrystallization at different temperature

2.8 温度对重结晶前后清液分子分布影响

淀粉经过脱支后，淀粉溶液为澄清状，采用高效液相色谱法测得脱支后上清液相对分子质量分布如图9 所示，48 h 重结晶完成后离心清液相对分子质量分布如图9（b）所示。出峰时间可以代表某一种相对分子质量的组分，峰面积大小可以反映组分含量多少。图中所示，从结晶前有出峰时间为21.0 min（组分 A）、23.5 min （组分 B） 到结晶后的 16.9 min（组分Ⅰ）和19.4 min（组分Ⅱ），出峰时间提前，重结晶完成后清液组分发生变化，清液中变成相对分子质量更大的组分，且重结晶温度对上清中两个主要组分含量有一定影响。

在较高温度40 ℃下，组分Ⅰ不存在；其他温度下，随温度升高而升高，常温与30 ℃差别较小；组分Ⅱ也是随温度升高而升高。 可知随着温度不同上清中淀粉小分子随着重结晶时间延长参于到重结晶沉淀的凝絮，结晶后清液中则是相对分子质量更大的淀粉分子。

图9 不同温度重结晶前后清液分子分布Fig. 9 Molecular distribution of supernatant before and after recrystallization

3 结 语

通过对支链淀粉脱支重结晶后上清和沉淀的多方面表征分析，来认识温度对淀粉分子重结晶特性的影响。 主要结论如下：支链淀粉酶解脱支重结晶低温（4 ℃）下絮凝速度快且沉淀得率高，上清中可溶性糖参于沉淀絮凝且随温度升高速度减慢；重结晶完成后清液组分发生变化，清液中变成相对分子质量更大的组分，且重结晶温度对上清中两个主要组分含量有一定影响，随着温度不同上清中淀粉小分子随着重结晶时间延长参于到重结晶沉淀的凝絮，结晶后清液中则是相对分子质量更大的淀粉分子。 不同温度下重结晶得到的淀粉沉淀，颗粒则均为为微小米粒状，大小差异不大，40 ℃颗粒接近微球状。与原淀粉相比粒径均减小，均一性变差。低温（4 ℃）重结晶得到的沉淀粒径最小，离散程度最小，颗粒均一性最好。 可而上清颗粒要比沉淀颗粒大，低温上清为表面光滑片状和少量圆棒状，温度升高仍为片状但是放大倍数下显示为大小均匀的圆形颗粒联结状。XRD 分析脱支重结晶淀粉沉淀物含有部分有序的晶体结构，而且较原淀粉相对结晶度随重结晶温度升高而增大，低温4 ℃上清物质失去淀粉结晶性，常温升高到40 ℃结晶度也逐渐变大。 红外分析显示沉淀和上清结构有序性随温度升高增强，与XRD 结果呼应。 热重分析显示沉淀的最大速率降解温度随着结晶温度的升高呈下降趋势，而上清液则是随着结晶温度升高而升高。