慢性心力衰竭患者血清高迁移率族蛋白B1对调节性T细胞免疫功能及预后的影响

谢芸 陈维平

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一种人体持续存在的心力衰竭状态，由于心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重以及炎症等造成的心肌损伤[1]。这种心肌损伤会使得人体的心肌结构以及功能发生变化，且在慢性心力衰竭的过程中，常常伴随出现一系列的并发症，从而对预后产生影响，其中肾功能不全是最常见的一种预后影响，被称为心肾综合症[2]。近些年发现，肌少症也是慢性心力衰竭患者的一种并发症，由于心力衰竭患者运动能力受限，而导致骨骼肌的质量及功能障碍[3,4]。已有研究表明，60%～80%的心衰患者至少有Ⅲ以上的肾功能问题，其肾小球的过滤能力也明显出现降低，平均过滤率从55.7 ml/min下降到43.1 ml/min，甚至更低达到30 ml/min，这严重影响心力衰竭患者的肾健康[5]。而肌少症在慢性心力衰竭患者中发病率达到了19.5%[6]，因此慢性心肌炎患者的预后作用较为重要，从而不断减少心衰患者的并发症。目前，关于HMGB1对健康人体T淋巴细胞增殖的研究较多，然而关于慢性心肌炎患者血清中高迁移率族蛋白B1对于T细胞的免疫功能影响以及预后的研究较少，基于此本文开展此项研究，以期分析HMGB1对于心力衰竭预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年8月到2018年8月到我院进行就诊的CHF患者50例(患病组)，选取50例同期来体检的健康者为对照组。2组受试者的性别比、年龄等差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 受试者的人口学特征 n=50,例

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：选取0～60岁CHF患者，被确诊为心力衰竭的患者满足以下症状：患者劳累时气短、端坐呼吸，易乏力、头晕，夜间睡眠时阵发性呼吸存在困难且咳嗽，放射性症状表现为肺水肿、心脏扩大以及叶间积水等。

1.2.2 排除标准：进行过心脏移植手术的病患；有恶性肿瘤、感染性疾病、严重肝肾疾病以及甲状腺疾病史的人群；入院时有其他重大外科手术及外伤的病患；以往有肾小球肾炎等肾病的患者。

1.3 方法

1.3.1 样本采集：所有受试者在清晨空腹时取外周静脉血35 ml，5 ml置于无抗凝管中凝固，离心后提取血清于冻凝管中，并将血清于-80℃的冰箱中保存待测。血清使用前室温下复溶后进行指标的测定。②外周静脉血T淋巴细胞的分离培养：将上述抽取剩下的30 ml外周静脉血加入肝素钠抗凝剂，与Hanks液1∶1混合均匀后，按2∶1比例加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞的分离液，500 g离心15 min后，取中间层加入5 ml的PBS洗涤后同样转速离心4 min，弃上层，加入2 ml的Lying solution，避光静置10 min后再次离心；弃上层液体，重复使用PBS洗涤离心2次后使用10%的小牛血清溶液重悬细胞，使用PBS稀释20倍后进行培养[7]。

1.3.2 酶联免疫法检测血清中HMGB1：采用酶联免疫法检测2组血清中的HMGB1水平，使用酶联免疫试剂盒进行检测，具体操作步骤严格按照试剂盒上的要求进行[8]。

1.3.3 T淋巴细胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA表达的测定：采用异硫氰酸胍一步提取法进行总RNA的提取[9]：将300 μl的变形裂解液加入EP管中，后加入2 mmol/L，pH值为4的NaAc 30 μl，再加入酚：氯仿：异丙醇(125∶24∶1)混合液300 μl，冰浴15 min后12 000 g、4℃离心20 min，取上次液体与等体积的的异丙醇混合于-20℃的冰箱中放置2 h，同样离心条件下离心15 min，加入75%的冷乙醇1 ml再次离心10 min后，弃上层用20 μl的无RNA的酶水解后-20℃保存总RNA，并进行总RNA的定量，后将RNA逆转录为cDNA后保存在-20℃冰箱里。IL-2、IL-2R以及内参β-actin引物的特异性检测[10]：首先进行BLAST的测试，后进行水浴条件下进行目的基因的PCR，97℃条件下变性反应5 min。反应完成后采用琼脂糖凝胶电泳来收集检测mRNA的表达量。

1.3.4 细胞培养液上清IL-2、sIL-2R浓度的检测：采用酶联免疫检测法来进行细胞培养液上清中IL-2及sIL-2R蛋白浓度的检测[11]。严格按照试剂盒上要求进行操作，主要操作步骤如下：首先进行标准品、抗体以及酶结合物的稀释，将标准品及检测样品中加样，室温条件下孵育60 min后进行洗涤，洗涤完成后加入100 μl的稀释酶结合物，再次洗涤3次后加入50 μl的底物，室温下孵育20 min，最后加入50 μl的终止液于450 nm的波长条件下检测OD值。

1.3.5 血清中氨基末端BNP前体的检测：采用电化学发光免疫法检测血清中氨基末端BNP前体的水平[12]。实验使用试剂盒进行操作，具体操作方法严格按照试剂盒上说明进行。

2 结果

2.1 2组血清中HMGB1水平比较 患病组血清中HMGB1含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清中HMGB1水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 2组别血清T淋巴细胞中IL-2及IL-2RmRNA表达 T淋巴细胞中IL-2及IL-2RmRNA表达，其中慢性心肌炎患者血清中IL-2mRNA及IL-2mRNA含量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组别血清T淋巴细胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA表达

注：与对照组比较，*P<0.05

2.3 2组上清IL-2、sIL-2R的蛋白浓度比较 细胞培养液上清IL-2、sIL-2R的浓度 患病组血清中IL-2及sIL-2R的蛋白含量均高于对照组，数差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组上清IL-2、sIL-2R的蛋白浓度比较

注：与对照组比较,*P<0.05

2.4 2组血清中氨基末端BNP前体含量比较 慢性心肌炎患者血清中氨基末端BNP前体的含量明显高于健康人群，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 2组血清中氨基末端BNP前体的含量比较

注：与对照组比较,*P<0.05

3 讨论

高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一种真核生物细胞核中高度保守的染色质蛋白，当释放至核外后，做为细胞因子参与机体的炎症反应调节中，在真核生物细胞中含量较多，因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率高而得名[13]。当由于感染及组织损伤导致细胞坏死时，HMGB1即释放；同时内毒素、促炎细胞因子激活的单核/巨噬细胞也将直接分泌高迁移率族蛋白B1[14]。分泌后的高迁移率族蛋白B1通过晚期糖基终产物受体以及其信号通路作用下，诱导肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素等炎性因子以及黏附分子发生转录，从而大量的炎性介质释放[15-17]。但已有研究表明，高迁移率蛋白B1具有较好的应用前景，其对于机体的免疫调节不局限于单向促炎作用，HMGB1可与TNF-α相互诱生，从而产生双向免疫活性的作用[18]。研究也表明，HMGB1含量与人体中的B型脑钠肽(BPN)水平呈现正相关的作用[19]。

已有研究表明，人体血清中的HMGB1水平可用于患者的心衰诊断中，当肌体组织受损或受到病原体的刺激时，细胞会将HMGB1分泌到细胞外[20]，从而诱导肌体发生炎性反应，因此慢性心肌炎患者血清中的HMGB1含量明显增高。研究发现，HMGB1在慢性心肌炎患者的病理中发挥着较大的作用，可做为心力衰竭的诊断指标之一，其作为真核生物细胞核内的染色质蛋白，当释放到细胞外即成为调节机体炎症的细胞因子[21]，在炎性反应免疫调节中扮演着重要的作用；释放到核外的HMGB1将活化树突状细胞、单核细胞以及巨噬细胞等抗原呈递细胞，从而不断调节机体中的免疫应答反应。HMGB1还对于一些干细胞具有化学趋化效应、介质黏附分子表达等作用[22]。至今发现的关于HMGB1拮抗治疗的手段已较多，有研究表明，关于脓毒症患者与HMGB1抗炎反应中，脓毒症的产生是由于机体促炎、抗炎失衡导致，二者交替抵抗过程中，抗炎机制占优势并导致免疫抑制，且HMGB1治疗脓毒症小鼠的研究已被证实[23]。同时研究表明，HMGB1对人体的T细胞功能亚群从促炎免疫应答优势转向抗炎免疫作用，从而不断发挥着作用，但目前关于HMGB1如何参与免疫平衡调节的具体过程，仍有待进一步的研究[24]。

研究表明，IL-2称为“淋巴因子”，其在T淋巴细胞的增殖分化以及免疫调节中发挥着重要的调节作用[25]，而IL-2R可由细胞表面脱落为可溶性的IL-2R，并与IL-2结合，IL-2R是T细胞活化的关键，结合IL-2后激活T细胞，从而参与慢性心肌炎患者的T细胞免疫过程。HMGB1在机体的免疫功能中扮演着很大的作用。而本文通过研究慢性心力衰竭患者血清中的HMGB1以及T淋巴细胞中IL-2以及IL-2R蛋白的表达等，发现慢性心力衰竭患病组HMGB1比对照组HMGB1高了1.05 ng/ml；慢性心力衰竭患者血清中IL-2mRNA及IL-2mRNA含量均高于健康对照组，IL-2 mRNA及IL-2 mRNA分别高了0.210 ng/ml及0.230 ng/ml；患慢性心力衰竭的患者血清中IL-2蛋白含量为0.166 μg/L，sIL-2R的蛋白含量为2.268 μg/L，患病组血清中IL-2及sIL-2R的蛋白含量均高于对照组；患病组血清中氨基末端BNP前体为3 176.2 pg/ml，而健康对照组血清中氨基末端BNP前体为2 114.1 pg/ml，慢性心力衰竭患者血清中氨基末端BNP前体的含量明显高于健康人群。

综上所述，慢性心肌炎患者血清中HMGB1含量高于健康人群，其增长促进了人体中T细胞的免疫过程，促进心肌细胞的再生，而升高的HMGB1可能与心力衰竭患者不良预后相关。