重黄温敏凝胶中重楼皂苷Ⅵ含量测定及体外释放研究*

孙 媛，丁江生，万近福

（云南省药物研究所，昆明 650111；2.云南白药集团创新研发中心，昆明 650111；3.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，昆明 650111）

重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-M.azz.或七叶一枝 花 Paris polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根茎，性凉，味苦，微寒，有小毒，归肝经。具有清热解毒、消炎消肿、凉肝熄风、利胆退黄、除风定痉、止血止痛、攻坚化积、截疟等功效。可补水、气、血，通气血。现代药理研究表明，重楼具有抗肿瘤、止血止痛、抗病毒，抑菌消炎和免疫调节及肝脏保护等作用。现已分离并鉴定出50余种化合物，主要为皂苷类成分，约占化合物总含量的80%。重楼皂苷具有抗肿瘤、清热解毒、消炎止痛、止血等功效，是云南白药、宫血宁等中成药的主要成分之一[1-6]。

重楼皂苷主要活性成分是甾体皂苷及苷元，其中又分为薯蓣皂苷类化合物和偏诺皂苷类化合物。《中华人民共和国药典》规定了薯蓣皂苷类化合物重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ和偏诺皂苷类化合物重楼皂苷Ⅵ、Ⅶ作为衡量重楼植物药用价值的指标。近年来的研究进一步表明偏诺类皂苷在药理活性上更具优势，特别是其中的重楼皂苷Ⅵ有止血、祛痰、抑菌、镇静镇痛、抗早孕杀灭精子、抗肿细胞等作用，临床用于治疗功能性子宫出血等。因此，采用主要含偏诺类皂苷的重楼提取物进行组方，制备重黄温敏凝胶。同时，鉴于偏诺皂苷类化合物的4个主要指标成分中重楼皂苷Ⅵ含量最低，也最易被干扰出现检测误差而影响重黄温敏凝胶的质量判断。因此，本实验选择重楼皂苷Ⅵ作为检测指标，采用高效液相色谱—蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）对重黄温敏凝胶的质量情况和体外溶蚀释放情况进行考察，为该药制剂成型和体内释药研究提供理论依据[7-10]。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦）；2000ES ELSD检测器（美国奥泰公司）；XWK-Ⅲ型空气发生器（天津市津分分析仪器制造有限公司）；ZRS—8G智能溶出实验仪（天津大学无线电厂）；THZ-82恒温振荡器 （金坛市富华仪器有限公司）；ETS--4fuzzy磁力搅拌器（德国 IKA）；AR2130型电子天平（美国Capintec公司）；Delta320 PH计（梅特勒托利多）；KH3200E黏度测定仪（昆山禾创超声有限公司）；KH3200E超声波清洗仪（昆山禾创超声有限公司）；DZKW-S-6电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗）。

1.2 试剂和药品 重楼皂苷Ⅵ对照品（中国食品药品检定研究院，批号111592-201203）；重黄温敏凝胶（自制）；泊洛沙姆 407（Poloxamer 407，德国 BASF公司）；泊洛沙姆 188（Poloxamer 188，德国 BASF 公司）；丙二醇（国药试剂集团）；乙腈（色谱纯，默克股份）；超纯水；其他试剂为分析醇。

2 方法与结果

2.1 重黄温敏凝胶的制备 精密称取处方量的重楼等提取物，加入丙二醇分散，再在连续搅拌下依次加入水、苯扎溴铵和泊洛沙姆407、泊洛沙姆188，搅拌直至完全溶解，加水定重，放置4℃冷藏24 h，即得。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 CAPCELL PAK C8色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，资生堂），乙腈（A）-水（B）为流动相，梯度洗脱（0～15 min，25%～35%A；15～35 min，35%～40%A；35～40 min，40%～60%A），柱温 25℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，漂移管温度92℃，载气流速2.9 L/min，增益2，撞击器关。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取重楼皂苷Ⅵ对照品21.5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，超声（150 W，40 kHz）5 min，摇匀，即得。

2.2.3 样品溶液制备 精密称取2.0 g重黄温敏凝胶，置于10 mL容量瓶中，加甲醇8mL，超声20 min，放冷，甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 专属性实验 分别将重楼皂苷Ⅵ对照品溶液、样品溶液、空白溶液以及样品加对照品溶液按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。此条件下重楼皂苷Ⅵ分离良好，无干扰。见图1。

2.2.5 线性关系和定量限考察 分别精密量取2.2.2项下重楼皂苷Ⅵ对照品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，按2.2.1项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积的常数对数值（lgA）对浓度的常数对数值（lgC）进行线性回归，得回归方程为：lgA=1.796 9 lgC+4.398 9（r2=0.999 9），0.430 0～4.300 0 mg范围内，线性关系良好。以信噪比（S/N）约为10的重楼皂苷Ⅵ对照品溶液为定量限：0.054 0 mg。

图1 专属性实验HPLC图

2.2.6 精密度实验 精密量取2.2.5项下对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算重楼皂苷Ⅵ的峰面积的RSD为1.51%（n=6），表明精密度良好。

2.2.7 稳定性实验 取同一份样品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算重楼皂苷Ⅵ的峰面积的RSD为3.08%（n=6），表明样品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性实验 精密称取2.0 g重黄温敏凝胶6份，按2.2.3项下要求，配制样品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算重楼皂苷Ⅵ的含量，RSD为2.70%（n=6），表明重复性良好。

2.2.9 回收率实验 精密称取已知含量的重黄温敏凝胶，分别按含量的50%、100%、150%精密加入重楼皂苷Ⅵ对照品，按2.2.3项制备样品溶液，每个浓度平行制备3份，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。见表1。

表1 加样回收率实验结果表（n=9）

2.2.10 含量测定 分别精密称取3批重黄温敏凝胶，按2.2.3项制备样品溶液，每个样品平行制备2份，按上述色谱条件测定，记录峰面积，计算含量，为标示量的90%～110%。见表2。

2.3 胶凝时间测定 采用试管倒置法来判断凝胶的相变温度：平行称取6份重黄温敏凝胶于试管中，将试管置于水浴中缓慢升温，于分别于（31.0±0.1）℃、（32.0±0.1）℃、（35.0±0.1）℃、（37.0±0.1）℃、（39.0±0.1）℃、（41.0±0.1）℃、（43.0±0.1）℃和（45.0±0.1）℃测定胶凝时间，每间隔30 s倾斜一次试管，直至凝固，记录时间。见图2。

表2 重楼皂苷VI含量测定结果表

图2 胶凝曲线图（n=6）

证明此温敏凝胶从（35.0±0.1）℃起，胶凝时间明显加快，在体温时（37±0.1）℃仅需（2.90±0.58）min即可成胶。

2.4 体外释放考察 取25 mL具塞试管，精密称取5.0 g重黄温敏凝胶于试管内，置于（37±0.1）℃恒温水浴振荡器中，待完全凝胶后，缓缓加入已脱气的pH4.0的磷酸盐缓冲液5.0 mL，平行制备6份样品，放入（37.0±0.1）℃恒温水浴振荡器中，振荡频率为120 r/min，于 0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、30、36、48 h取样，取出全部溶蚀介质，称重后将试管放回恒温水浴振荡器中胶凝，缓慢补加相同温度的空白溶蚀介质5.0 mL，重复操作，直至剩余凝胶质量不足初始重量的10%。相邻时间点间质量差异即为重黄温敏凝胶溶蚀量。每个时间点取样后，按相应比例加入甲醇稀释至规定体积，0.45 μm微孔滤膜过滤，采用上述色谱条件进行检测，记录峰面积，计算重楼皂苷Ⅵ的累积释放量。并对各时间点的药物累积释放率进行探讨。见表3和图3。

表3 重黄温敏凝胶溶蚀释放拟合表

图3 重黄温敏凝胶pH4.0缓冲液中溶蚀释放情况

结果显示，重黄温敏凝胶溶蚀量和重楼皂苷Ⅵ体外释放均符合Higuchi方程，12 h释放67.63%，24 h释放85.65%。表明重黄温敏凝胶在人体阴道微环境中释药，基质溶蚀是限速条件。

3 讨论

2015 版《中华人民共和国药典》重楼项下的紫外检测波长为203 nm，重黄温敏凝胶在该波长下测定时重楼皂苷Ⅵ干扰明显，无法达到预期检测效果。本研究采用HPLC-ELSD检测，不仅药典项下的4种重楼皂苷实现良好的分离检测，还将偏诺重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷PA和重楼皂苷H进行了较好的分离，为进一步研究重楼偏诺皂苷提供了技术支持。

重黄温敏凝胶的体外溶蚀释放符合Higuchi方程，且在12 h释放可达67.63%，不仅满足用药需求，还能减少药物给药次数，保证药效的同时，增加患者的用药顺应性，为重黄温敏凝胶制剂推广提供依据。

本实验主要对药物从重黄温敏凝胶制剂中释放的情况进行了研究，对于释放后在人体阴道中的吸收利用情况还需进一步探讨。

重黄温敏凝胶需在体内以半固体形态存在，且随着处方中黏性物质比例的增加，凝胶强度进一步加大，药物释放较低温时的液体形态发生明显改变。因此，体外溶蚀释放研究对药物的利用和疗效有指导意义。