衰老标记蛋白30在糖尿病小鼠视网膜中的表达△

王洁 李思雨 谢子康 左慧懿 唐承业 唐东永 忠昕 梁皓

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是引起糖尿病患者不同程度视力障碍甚至失明的一种高度特异性神经血管并发症，其早期临床表现包括微动脉瘤形成和视网膜内出血[1]。目前，DR眼内治疗主要有视网膜激光光凝、玻璃体内注射抗血管内皮生长因子和类固醇药物、玻璃体视网膜手术，这些治疗仅针对视网膜已发生不可逆损伤的DR晚期阶段且存在许多并发症和副作用[2-3]。因此，有必要早期识别、预防或解决DR的早期病理损伤。DR以往被认为是微血管疾病，然而在糖尿病的早期阶段，患者眼底检查未发现明显微血管异常时已发现存在对比敏感度降低、暗适应延迟和视野异常等视网膜功能异常[4-5]，如今研究者已意识到DR早期存在神经元功能障碍和神经退行性变[6]。值得注意的是，衰老是神经退行性疾病的最大风险因素，年龄增加会导致神经元变性和视觉系统功能下降[7]。事实上，糖尿病和衰老有密切联系，糖尿病导致的多器官系统功能障碍(认知障碍、心血管疾病、肾功能不全、骨质疏松和视力障碍等)与衰老类似，且越来越多证据表明二者之间存在平行分子机制，包括细胞衰老、免疫炎症、蛋白稳态异常、mRNA加工异常和DNA损伤修复障碍等[8]。根据糖尿病与衰老之间生物学联系的提示，本研究尝试考虑从糖尿病和衰老中共同作用因子角度去探寻针对DR早期干预的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物选取20只SPF级昆明小鼠，雄性，6周龄，体质量(22±2)g，由广西医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002。本研究已获广西医科大学实验动物福利与伦理委员会批准。

1.1.2 药物及试剂链脲佐菌素(Sigma)；SP试剂盒、DAB显色试剂盒(中杉金桥)；抗衰老标记蛋白30(senescence marker protein 30,SMP30)抗体(Abcam);反转录试剂盒、Real Time PCR反应试剂盒(Takara)。

1.2 方法

1.2.1 与糖尿病和衰老共同相关基因的筛选从在线数据库Rat Genome Database(RGD；http://rgd.mcw.edu)[9]分别搜索与人类糖尿病和衰老有关的基因，该数据库提供了与实验鼠相关的最全面的数据存储库和信息学平台，包含大鼠、小鼠和人类的各种疾病相关基因信息。将上述获取到的两组基因取交集，筛选出与糖尿病和衰老共同相关基因。

1.2.2 相互作用分析为了解上述筛选所得基因之间的相互作用关系，分别使用STRING(https://string-db.org/)[10]和GeneMANIA(http://www.genemania.org/)[11]构建了蛋白质-蛋白质和基因-基因相互作用网络图。

1.2.3 富集分析使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[12]研究上述基因涉及的生物学功能和通路，包括GO分析和KEGG通路，其中GO分析又包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞成分(cellular component,CC)3个部分，富集分析结果P<0.05为有相关性。

1.2.4 小鼠糖尿病模型建立将小鼠用普通饲料适应性喂养1周后，随机分为对照组和糖尿病组，每组各10只。糖尿病组小鼠改用高脂饲料喂养1个月后行腹腔注射STZ溶液40 mg·kg-1，按上述剂量连续注射处理3 d，对照组用同等剂量的柠檬酸缓冲液处理。注射前小鼠过夜禁食不禁水12 h，注射STZ后糖尿病组小鼠高脂饲料维持喂养。注射1周后行小鼠尾静脉采血测量空腹血糖，空腹血糖≥11.0 mmol·L-1为糖尿病模型建立成功。造模过程中糖尿病组2只小鼠死亡，剩下8只继续高脂饲料喂养1个月后颈椎脱臼法处死。

1.2.5 取材颈椎脱臼法处死小鼠后，快速摘出眼球于PBS缓冲液中稍加漂洗，浸没于100 g·L-1多聚甲醛溶液中，4 ℃保存用于制作病理切片。同上述方法摘出眼球后，置于装有PBS缓冲液的培养皿中。用眼科无齿镊夹住眼球后部的视神经断端，将眼球前部调至显微镜视野中央。用有齿镊钳夹巩膜固定眼球，然后用角膜剪沿角巩膜缘剪下角膜。用镊子将晶状体挑出后，用PBS缓冲液反复冲洗剩余眼球内壁,去除残留玻璃体后，用镊子将视网膜完整剥离下来后转移至EP管，-80 ℃保存。

1.2.6 HE染色观察小鼠视网膜结构摘除的小鼠眼球于体积分数10%中性甲醛溶液固定24 h后，梯度酒精脱水后石蜡包埋，切片厚5 μm。将切片于二甲苯中二次脱蜡，每次5 min；于梯度乙醇中进行水化后浸于蒸馏水中2 min。苏木素染色1 min冲洗、体积分数1%盐酸酒精中分化10 s、温水中浸泡15 min。伊红染色2 min后冲洗、浸泡、脱水后封片。使用数字病理切片扫描仪扫描切片，用切片浏览软件NDP.view2进行阅片。

1.2.7 免疫组织化学法检测小鼠视网膜组织中SMP30蛋白表达将小鼠视网膜切片脱蜡复水后进行高压修复抗原。内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min、正常山羊血清工作液室温孵育15 min进行封闭、预先稀释的一抗(稀释比例1800)4 ℃过夜。生物素标记山羊抗小鼠IgG室温孵育15 min、辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育15 min，滴加 120现配DAB显色工作液后于显微镜下观察显色反应。苏木素复染，脱水后封片。扫描切片和阅片同上，图像数据分析使用Image J软件。

1.2.8 RT-qPCR检测小鼠视网膜组织中SMP30 mRNA表达使用总RNA制备试剂盒提取小鼠视网膜组织中的总RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度计测量总RNA的浓度和纯度。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒去除总RNA样品中残留的基因组DNA并合成cDNA，去除基因组DNA反应液和反转录反应液按试剂盒说明书进行配置。反转录反应条件：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s，合成的cDNA于-20 ℃保存。采用TB Green嵌合荧光法进行实时定量PCR，按照试剂盒操作手册中提供的方法配置PCR反应液和进行两步法PCR反应程序。采用2-△△Ct法行mRNA的相对定量分析。PCR引物序列如下，SMP30正向引物：5’-TGTGTTTTACGGGAGAACTACA-3’，反向引物：5’-ACCGTATCCCATCGACAAATAA-3’。内参β-actin的正向引物：5’-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3’，反向引物：5’-ATGCCACAGGATTCCATACC-3’。

1.3 统计学方法使用GraphPad prism 7进行统计分析和绘图。本研究数据结果以均数±标准差表示，不同组间行两样本t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 与糖尿病和衰老共同相关基因的筛选结果共搜索到与人类糖尿病相关基因1146个、与衰老相关基因408个，二者之间重叠的基因有11个，分别为超氧化物歧化酶2(SOD2)、钙调素(RGN/SMP30)、蛋白激酶Cα型(PRKCA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、丛生蛋白(CLU)、NAD依赖性蛋白脱乙酰酶 Sirtuin 3(SIRT3)、Werner综合征ATP依赖解旋酶(WRN)、自闭症易感基因蛋白2(AUTS2)、ATP合酶亚基(MT-ATP6)、烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)、肿瘤蛋白63(TP63)。上述11个基因在蛋白和基因水平上有相互作用关系。

2.2 富集分析生物学功能评估显示，11个基因主要富集于神经元凋亡过程、NO生物合成过程的正调控、凋亡过程负调控、细胞衰老、染色体结合等；KEGG通路分析显示与线粒体生物发生和HIF-1信号通路相关。

2.3 HE染色观察小鼠视网膜结构对照组小鼠视网膜10层结构排列较为规整，内界膜平整。糖尿病组小鼠视网膜各层排列较不规则，内界膜不规则较为明显，神经节细胞排列错落、紊乱。见图1。

2.4 小鼠视网膜中SMP30蛋白的表达2组小鼠视网膜均可观察到SMP30蛋白免疫阳性反应(图2)。SMP30蛋白免疫阳性反应主要位于细胞胞浆内，分布于小鼠视网膜各层，其中神经纤维层、神经节细胞层、外丛状层SMP30蛋白免疫阳性产物表达较强。糖尿病组小鼠视网膜各层SMP30蛋白免疫阳性产物表达(7.57±0.49)明显较对照组(25.20±2.45)弱(t=7.057,P<0.01)。

图1 小鼠视网膜的形态结构(HE染色，×20) A：对照组；B：糖尿病组(箭头示神经节细胞排列错落、紊乱)。RPE：视网膜色素上皮层；LRC：视杆视锥层；ELM：外界膜；ONL：外核层；OPL：外丛状层；INL：内核层；IPL：内丛状层；GCL：神经节细胞层；NFL：神经纤维层；ILM：内界膜

图2 小鼠视网膜SMP30蛋白的表达情况 A：对照组；B：糖尿病组

2.5 RT-qPCR检测视网膜中SMP30 mRNA的表达糖尿病组小鼠视网膜中SMP30 mRNA(0.51±0.12)的表达与对照组(0.96±0.02)相比显著降低(t=3.717,P=0.02)。

3 讨论

DR病理学涉及多元醇途径通量、高级糖基化终产物(AGE)、蛋白激酶C(PKC)的激活和增加己糖胺通路通量这4种经典机制，且这些途径都与活性氧自由基(ROS)的过量产生相关，ROS的积累会引起氧化应激，最终导致视网膜损伤[13]。通过使用RGD数据库共筛选出11个与人类糖尿病与衰老相关的重叠基因，它们在蛋白和基因水平上存在相互作用关系，其中几个已被证实是参与DR发病机制的重要因子。SOD2是抗氧化酶体系中的重要成员[14]，而高血糖引起ROS产生与抗氧化防御系统之间的不平衡激活了几种促进DR发病的氧化应激相关机制，且即使在血糖浓度恢复到正常水平后，氧化应激造成的损害仍然持续存在较长时间[13]。高血糖引起的ROS升高会降低GAPDH活性，导致上游糖酵解代谢产物增加，从而导致多元醇途径通量的增加；GAPDH受抑制会导致磷酸二羟基丙酮水平升高，从而导致甘油二酯(DAG)浓度升高和PKC活化[15]。

与上述基因有相互作用关系的SMP30，最初于大鼠肝脏组织中作为Ca2+结合蛋白被发现[16]，而后被发现广泛分布于肾脏、心脏、脑、肺等组织[17]，且其表达水平会随着年龄增加而降低，这种年龄相关性的特征也正是它命名的起源[18]。SMP30现已被证实为一种多效蛋白，其具有抗氧化应激[19]、调节细胞Ca2+依赖性和非依赖性信号转导[20]、调控细胞增殖与凋亡[21]和维生素C生物合成必需的葡萄糖酸内酯酶等功能。最近研究显示，SMP30 mRNA和蛋白表达随着各种代谢性疾病(非酒精性脂肪肝、糖尿病性肾病和骨质疏松症)的发生而改变，并且研究证据提示SMP30可能是参与葡萄糖代谢和脂质代谢的关键因子[22]。本研究发现，SMP30在糖尿病组小鼠视网膜中的表达低于对照组，这与在糖尿病小鼠的肝脏[23]和肾脏[24]中检测到SMP30表达趋势下降是一致的。

DR长期以来被归类为糖尿病微血管并发症，现其已被定义为高度特异性的神经血管并发症[25]。许多使用视网膜电图、暗适应、对比敏感度和色觉测试的研究已证明，在发现明显微血管改变之前神经视网膜功能已经受损[4,26]。本研究中糖尿病小鼠视网膜病理结构变化显示，视网膜神经节细胞排列紊乱，视网膜内膜面极不平整。此外，本研究的富集分析显示，包括SMP30在内的基因与神经元的凋亡相关。这提示视网膜神经损伤和SMP30表达降低相关。据报道，糖尿病大鼠视网膜中胰岛素受体底物(IRS)-2的表达降低，IRS-2缺失导致视网膜内神经元和感光细胞的变性[27-28]。长期的视网膜胰岛素信号转导紊乱不仅会导致细胞损伤，还会损害胰岛素依赖性蛋白的合成[29]。有许多证据显示，SMP30涉及胰岛素信号转导[30-32]。胰岛素在体内外均能刺激肝细胞中SMP30的表达[30-31]。SMP30基因敲除小鼠在给予葡萄糖后出现轻度葡萄糖耐量下降和急性胰岛素分泌受损，且高脂饮食严重加剧了SMP30基因敲除小鼠的糖耐量[32]。此外有研究显示，SMP30过表达通过减少ROS的产生并增加抗氧化剂防御酶的活性来保护肝脏和心肌细胞免受氧化应激的影响[33-35]。相反地，SMP30基因敲除小鼠表现出比野生型对照小鼠更高的氧化应激水平[36]。

综上所述，SMP30可作为DR早期的干预靶点，上调SMP30表达可能是保护视网膜神经组织免受糖尿病状态下胰岛素信号紊乱和氧化应激导致损伤的新途径。